чем, была (и остается!) чрезвычайно захватывающей без всяких преувеличений.
Открытия Вернера Арбера, Даниела Натанса и Хамилтона Смита ознаменовали начало новой эры в развитии генетики. Как наука она сформировалась более 150 лет назад, начавшись с экспериментов Грегора Менделя (он доказал, что у нас есть гены, каждый из которых выполняет конкретную функцию и передается из поколения в поколение). Вторая эра генетики началась в 1940–50-х годах, когда была установлена ключевая роль ДНК в хранении и передаче наследственной информации. Генетика стала молекулярной, приобрела химическую основу. Ученые узнали, что ген представляет собой фрагмент ДНК, которая содержит код для синтеза белков. Были сделаны фундаментальные открытия в области молекулярной генетики, в 1960–70-х годах более четверти Нобелевских премий по физиологии или медицине вручались за исследования именно в этой области.
Большинство опытов проводилось на бактериях и вирусах, но результаты их применимы к людям. Однако жизнедеятельность человеческого организма зависит от множества управляемых генами биологических процессов, которых нет у микроорганизмов. Перед учеными стояло много вопросов. Например, было непонятно, как генетически регулируется развитие одной оплодотворенной яйцеклетки в полноценный уникальный организм? Какой механизм заставляет клетки различных органов сохранять свои специализированные функции? В течение 1950–60-х годов ученые интенсивно работали, чтобы ответить на эти вопросы, но им казалось, что они стучатся в закрытую дверь.
Трудности в этой области исследований возникали в основном из-за колоссального количества информации, содержавшейся в генах. ДНК одной клетки человека можно сравнить с книгой, где описывается вся история развития этой клетки и информация о ее функционировании. Текст, написанный на одной странице этой книги, будет соответствовать одному гену, содержащему информацию, необходимую для синтеза одного белка. А вся книга будет состоять из миллиона страниц, для нее потребовалась бы книжная полка длиной в тысячу метров. При каждом делении клетки вся эта условная книга копируется, а единственная ошибка на одной из страниц может привести к болезни или смерти. Изменить текст этой книги могут химические вещества или вирусы – и это приводит к онкологическим заболевания, врожденным порокам развития или к наследственным заболеваниям. Если ученый захочет прочитать книгу и найти самые опасные опечатки, то он обнаружит, что ее страницы склеены. Как же можно разделить листы, не повредив при этом текст?
Открыть запечатанную книгу позволяют ферменты рестрикции. Швейцарец Вернер Арбер обнаружил их в начале 1960-х годов, когда изучал изменения, которые происходят в бактериях под воздействием инородной ДНК. Этот процесс называют модификацией, контролируемой клеткой-хозяином. В серии простых, но эффектных экспериментов Арбер показал, что это явление было вызвано изменением ДНК и, видимо, служило для защиты хозяина от чужеродных генов. Чужеродная ДНК, попавшая в бактерию, разрушалась. Поэтому ученый предположил, что бактерии содержат ферменты рестрикции, которые способны распознавать повторяющиеся структурные элементы ДНК и связываться с ними. В местах связывания нити ДНК разъединялись – открывались страницы книги.
Американец Хамилтон Смит проверил гипотезу Арбера. Исследователь выделил один из ферментов рестрикции в чистом виде и показал, что именно он может расщеплять чужеродную ДНК. Смит определил химическую структуру областей ДНК, разъединявшихся под воздействием фермента, а позже обнаружил определенные правила, которые могли применяться для описания ферментов. Все они расщепляли ДНК, причем каждый работал только на определенном участке. С их помощью гигантские молекулы ДНК могли быть разрезаны на заранее известные сегменты, которые впоследствии можно было использовать для структурных исследований или генетических экспериментов.
Последний шаг в развитии технологии редактирования генома сделал еще один американец – Даниел Натанс. Он первым применил ферменты рестрикции в экспериментальной генетике, и его работа стала источником вдохновения для ученых во всем мире. Расщепив вирусную ДНК с помощью ферментов рестрикции, Натанс построил первую генетическую карту вируса SV40. Методика, разработанная им для этой цели, была позже использована другими учеными для создания более сложных карт. Таким образом, достаточно быстро удалось построить полную генетическую карту вируса, который начал исследовать Натанс.
Применение ферментов рестрикции произвело революцию в генетических исследованиях высших организмов и полностью изменило представления человечества об их геноме. Были обнаружены кодирующие и некодирующие участки ДНК, ферменты рестрикции были использованы также для генной инженерии. С их помощью ученые научились выборочно удалять из клеток части генетического материала или, наоборот, встраивать в ДНК новые фрагменты.
Эти эксперименты почти сразу вызвали опасения этического характера – о копировании человека и редактировании его генома. Но на самом деле в конце 1970-х годов до этого было еще очень далеко. Даже в наши дни ученые делают лишь первые шаги в генной терапии, пытаясь отредактировать геном больных людей и таким образом вылечить их. Людям, живущим в XXI веке, только предстоит увидеть грандиозные успехи генной инженерии, зародившейся именно благодаря работе Арбера, Натанса и Смита. В 1978 году они получили Нобелевскую премию «за открытие ферментов рестрикции и их применение для решения проблем молекулярной генетики».
Современные методы редактирования генома с помощью ферментов рестрикции используют конструирование искусственных белков для каждой конкретной манипуляции. В этом заключаются так называемый метод цинковых пальцев и технология TALEN. Но в последнее время появился еще один простой и очень эффективный метод – технология CRISPR-Cas9. Для узнавания нужных фрагментов ДНК она использует искусственную РНК. Этот метод получил широкое распространение благодаря относительной простоте реализации: ведь сконструировать РНК гораздо проще, чем белок.
ГЛАВА 3. Микровраги человеческие: от палочки Коха до ВИЧ
Туберкулезная палочка, или с чего началась микробиологияРоберт Кох
Часто истории исследований, которые триумфально заканчивались Нобелевской премией, происходили благодаря близким людям врачей и ученых. Путь Ильи Мечникова к изучению защитных механизмов организма от инфекций начался с трагического события – смерти от туберкулеза его молодой жены. У Роберта Коха решающий поворот в жизни случился, когда в подарок на свое 28-летие он получил от супруги хороший микроскоп. После этого Кох оставил не очень успешную медицинскую практику, завел кучу лабораторных мышей и целые дни проводил за микроскопом, наблюдая и фотографируя микромир. В результате ученый выделил в чистом виде и описал возбудителей сибирской язвы, туберкулеза и холеры (холерный вибрион), чем завоевал признание в научном мире: стал главой европейских микробиологов и основоположником немецкой школы бактериологов. Нобелевская премия была вручена Роберту Коху в 1905 году «за его исследование и открытия в отношении туберкулеза» – вероятно, потому, что именно это заболевание было самой распространенной причиной смерти в XIX веке, в том числе в Германии.
Слава пришла к Коху благодаря тому, что он открыл и довел до совершенства три революционных метода в исследовании микробов.
Во-первых, до него исследователи наблюдали микробов в их естественной окраске, то есть бесцветными. Учитывая уровень оптики позапрошлого века, это часто не давало возможности даже заметить микроб – особенно если его оптическая плотность мало отличалась от оптической плотности окружающих тканей. Кох применил анилиновые красители, которые избирательно окрашивали только тела микробов, и наблюдения за ними стали гораздо более результативными. Это подняло микробиологические исследования на новый научный уровень.
Во-вторых, Роберт Кох сумел значительно повысить разрешающую способность микроскопа и получить изображения, увеличенные в 900–1400 раз. Для справки: до этого предельное увеличение составляло 400–500 раз. Как Кох добился такого результата? Дело в том, что он использовал иммерсионный объектив: погрузил линзу микроскопа в жидкое масло, что усилило ее выпуклость, и, соответственно, увеличение стало больше. Микрофотографии окрашенных микробов, которые при этом делал Кох, произвели неизгладимое впечатление на его современников. Но не надо думать, будто у Коха все проходило гладко и что это очень просто – работать с иммерсионным объективом. Когда один из авторов этой книги училась на биофаке МГУ, она с однокурсниками разбила не одно покровное стекло на микробиологических препаратах, пока не научилась точным движением опускать объектив микроскопа ровно на нужную величину, до получения резкого изображения.
В-третьих, Кох изобрел твердые питательные среды. Говорят, это получилось благодаря тому, что он забыл на столе разрезанную картофелину. А вообще-то тогда микробов выращивали в питательном бульоне, что затрудняло получение чистой культуры возбудителя. При нанесении же смеси микробов на твердую питательную среду каждый микроорганизм становился родоначальником собственной колонии на том самом месте, где он на нее попал. Кох использовал несколько таких сред – например, агар-агар и желатин, их до сих пор применяют в биологии для выращивания, изолирования и изучения чистых культур.
Используя эти три метода, Кох добился значимого результата. Ткани умершего туберкулезного больного из клиники, находившейся рядом с его сельским домом, он окрасил метиленовой синькой, а затем едкой красно-коричневой краской, используемой при выделке кожи. Рассматривая препарат в микроскоп, ученый обнаружил слегка изогнутые, окрашенные в ярко-синий цвет палочки. Последователи микробиолога позже назвали их «палочками Коха». Так был открыт возбудитель туберкулеза и началась серьезная борьба с ним.