Данный метод характеризуется высокой погрешностью и недостаточно высокой эффективностью, поскольку содержание ароматических аминокислот отличается в различных белках сыворотке крови.
При изучении белкового спектра крови в качестве унифицированного метода используется зональный электрофорез с поддерживающей средой-носителем.
Принцип метода
Под влиянием постоянного электрического поля белки сыворотки, имеющие отрицательный заряд, движутся по смоченной буферным раствором бумаге по направлению к положительному электроду со скоростью, зависящей от величины заряда и молекулярной массы частиц. Вследствие этого белки сыворотки крови разделяются на 5 фракций: альбумины, α1-, α2-, β-, γ-глобулины.
Альбумины обладают выраженным отрицательным зарядом и небольшой молекулярной массой, поэтому они продвигаются в электрическом поле с наибольшей скоростью и дальше других фракций отстают от линии старта. С меньшей скоростью движутся α1-, α2– и β-глобулины.
Наименьшей скоростью продвижения отличаются γ-глобулины, они практически остаются на линии старта. γ-глобулины – крупные белковые молекулы, их заряд близок к нейтральному.
Окрашенные пятна белковых фракций, полученные методом электрофореза на бумаге или других носителях, носят название электрофореграммы.
Измерения и Расчет содержания белковых фракций проводят при денситометрическом сканировании электрофореграмм. Получаемые денситограммы представляют собой графики зависимости оптической плотности и подвижности каждой фракции. Площадь пика пропорциональна количеству белков, находящихся в соответствующей фракции.
Каждая фракция имеет определенный состав белков. Процентное содержание отдельных белковых фракций меняется при многих заболеваниях, хотя общее содержание белка в сыворотке крови может оставаться в пределах нормы (диспротеинемия).
С помощью электрофореза можно провести первый этап оценки следующих патофизиологических процессов: иммунодефицит, активация гуморального звена иммунитета, воспалительный процесс, активация комплемента, снижение синтеза белка, состояние потери белка, внутрисосудистый гемолиз, генетические варианты белков, моно- и поликлональные γ-патии (парапротеинемии).
У здоровых людей содержание альбумина составляет 56,3–68,8 %, α1-глобулинов – 3–5,8 %, α2-глобулинов – 6,9–10,5 %, β-глобулинов – 7,3–12,5 %, γ-глобулинов – 12,7–19,2 %.
Унифицированный метод электрофоретического разделения на пленках из ацетата целлюлозы
Необходимые реактивы
1. 5,5-диэтилбарбитуровой кислоты натриевая соль (мединал), фарм.
2. Лимонная кислота.
3. Барбитал-цитратный (мединал-цитратный) буфер рН 8,6: 7,36 г 5,5-диэтилбарбитурата натрия (мединала), 0,3 г лимонной кислоты растворяют в 700 мл воды в мерной колбе вместимостью 1 л, проверяют рН и доводят водой до метки.
4. Бромфеноловый синий водорастворимый, индикатор.
5. Ртуть двухлористая (сулема, хлорная ртуть).
6. Уксусная кислота ледяная.
7. Пунцовый С.
8. Кислотный красный 2Ж.
9. Трихлоруксусная кислота, раствор 50 г/л.
10. Растворы для окрашивания:
– раствор бромфенолового синего, 0,5 г/л: 10 г двухлористой ртути и 20 мл ледяной уксусной кислоты растворяют в небольшом количестве воды при нагревании на водяной бане, непрерывно помешивая до полного растворения сулемы. Отдельно растворяют 0,5 г бромфенолового синего в воде. Оба раствора помещают в мерную колбу вместимостью 1 л и доводят водой до метки;
– раствор пунцового С: 0,3 г краски растворяют в 100 мл 50 г/л раствора трихлоруксусной кислоты;
– раствор кислого красного 2Ж: 0,3 г краски растворяют в 100 мл 50 г/л раствора трихлоруксусной кислоты.
11. Отмывающий раствор – уксусная кислота, 50 г/л раствор.
12. Просветляющие растворы:
– вазелиновое масло;
– смесь: ледяная уксусная кислота и ацетон (1: 1).
Специальное оборудование
1. Прибор для электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы.
2. Пленка из ацетата целлюлозы.
3. Денситометр.
Ход определения
Подготовка прибора: прежде чем приступить к работе, необходимо ознакомиться с инструкцией по эксплуатации прибора. В соответствии с инструкцией заполняют камеры прибора буферным раствором. Следят, чтобы уровень буфера был одинаковым в обеих камерах.
Подготовка пленок из ацетата целлюлозы: смачивают пленки буферным раствором (помещают в буферный раствор на 5 мин). Удаляют избыток влаги фильтровальной бумагой. Закрепляют пленку матовой стороной кверху (пленки должны располагаться параллельно друг другу и строго параллельно стенкам прибора, не должны провисать). Закрывают камеру крышкой и пропускают ток напряжением 150 В в течение 5 мин, после чего выключают ток.
Нанесение сыворотки: на катодный край пленки наносят 1–4 мкл сыворотки в виде узкой полоски, так чтобы полоски не доходили до края пленки.
Проведение электрофореза: включают ток и проводят электрофоретическое разделение в течение 20 мин при напряжении 150 В и силе тока 1 мА на 1 см поперечного сечения полоски.
Обработка пленок из ацетата целлюлозы: выключают ток, вынимают пленки, высушивают их вначале на воздухе в течение 5–10 мин, затем (для фиксации) в сушильном шкафу при 100 °C в течение 10 мин. Окрашивают в течение 15 мин одним из указанных красителей, после чего пленки несколько раз отмывают от избытка красителя 50 г/л раствором уксусной кислоты до исчезновения фона (3–4 раза). После отмывки пленки промокают фильтровальной бумагой и высушивают на воздухе. Затем пленки просветляют в одном из просветляющих растворов.
Расчет
Измерение проводят на денситометре. Результаты выражают в процентах.
Примечания
1. Можно использовать барбиталовый (мединал-вероналовый) буфер такого же состава, как и для электрофореза на бумаге.
2. После проведения электрофореза буфер из катодной и анодной камер смешивают, что дает возможность использовать его несколько раз.
Электрофоретическое разделение на бумаге
Необходимые реактивы
1. Буфер. Можно использовать различные виды буферов – мединал-вероналовый, боратный, трис-буфер:
– мединал-вероналовый буфер рН 8,6: 10,3 г мединала и 1,84 г веронала растворяют и доводят до 1 л водой;
– трис-буфер рН 8,9: трис-(оксиметил) – аминометан – 60,5 г, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) – 6 г, борная кислота – 4,6 г, вода – до 1 л.
2. Раствор красителя. Используют различные красители – бромфеноловый синий, амидо черный, азокармин Б и др.: 1 г бромфенолового синего и 20 г двухлористой ртути (сулемы) растворяют в воде, добавляют 40 г ледяной уксусной кислоты и доводят водой до 2 л. Хранят в посуде из темного стекла.
3. Раствор для элюирования – натр едкий, 0,03 моль/л.
Специальное оборудование
1. Прибор для электрофореза на бумаге.
2. Хроматографическая фильтровальная бумага марки «Б» (качество фильтровальной бумаги имеет большое значение: она должна быть однородной и плотной).
Ход определения
Подготовка прибора: в камере необходимо поддерживать определенную влажность воздуха, чтобы предохранить фильтровальную бумагу от высыхания. Для этого прибор закрывают крышкой. Буферный раствор в разных отделах камеры должен иметь одинаковый уровень, чтобы избежать переливания жидкости через ленту.
Подготовка бумаги: полосы фильтровальной бумаги смачивают раствором свежего буфера. Избыток буфера удаляют, отжимая полосы между лентами фильтровальной бумаги, и помещают их в электрофоретическую камеру.
Бумажная лента может быть расположена горизонтально (горизонтальный электрофорез) или под углом (вертикальный электрофорез). При горизонтальном электрофорезе бумажная лента должна быть хорошо натянута.
Нанесение сыворотки: на край ленты наносят по 5–10 мкл негемолизированной сыворотки в виде поперечной полосы, отступив на 0,5 см от краев.
Проведение электрофореза: камеру закрывают крышкой и проводят электрофорез сыворотки в течение 6–24 ч при напряжении от 3 до 8 В на 1 см пути тока. Продолжительность электрофореза устанавливают в зависимости от силы и напряжения тока, вида буферного раствора, рН, длины, ширины и толщины бумажных полос.
Обработка бумажных полос: выключают ток, вынимают ленты, помещают в сушильный шкаф на 10 мин при температуре 105 °C и красят, погружая в раствор красителя на 20 мин. Краситель сливают и ленты несколько раз промывают 20 г/л раствором уксусной кислоты до устранения фона (окрашенные участки бумаги, свободные от белка). Ленты вновь просушивают на воздухе.
Расчет
Измерение проводят на денситометре или на фотометре после элюирования. Результаты выражают в процентах.
Элюирование: кусочки ленты, содержащие отдельные фракции, вырезают и помещают в пробирки для элюирования. Для этого в каждую пробирку с глобулиновой фракцией приливают по 10 мл 0,02 моль/л раствора NaOH, к альбуминовой фракции – 20 мл и оставляют в течение 1–2 ч. Измерение проводят в кювете с толщиной слоя 1 см против 0,02 моль/л раствора NaOH при 500–560 нм (зеленый светофильтр). Величину экстинкции альбуминов умножают на 2. Определяют сумму экстинкции всех фракций, принимая ее за 100 %, и вычисляют долю каждой фракции.
Клинико-диагностическое значение
Альбумин является основным онкотическим компонентом плазмы, служит в ней основным резервом азота, его роль в транспорте билирубина, желчных кислот, ионов металлов, лекарств существенно зависит от концентрации.
Абсолютной гиперальбуминемии не существует. Любое состояние, связанное с потерей воды, повышает концентрацию всех белков плазмы, включая альбумин, вызывая относительную гиперальбуминемию.
Снижение содержания альбумина встречается при многих заболеваниях: остром и хроническом воспалении, ревматических болезнях, термических ожогах, грануломатозных процессах, большинстве бактериальных инфекций, вирусных инфекциях с разрушением тканей, некрозах ткани (в частности, при злокачественных процессах), васкулитах, язвенных поражениях кишечника, серози