7. Бензойная кислота, 2 г/л. 0,2 г кристаллической бензойной кислоты растворяют в 100 мл воды при интенсивном перемешивании на водяной бане.
8. Мочевина для приготовления калибровочного раствора. Готовят 7 ммоль/л раствор мочевины: 42 мг мочевины растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл. В качестве растворителя можно использовать 2 г/л раствор бензойной кислоты. Калибровочный раствор, приготовленный на растворе бензойной кислоты, стабильнее, чем водный; 1 мл калибровочного раствора содержит 0,007 ммоль мочевины.
9. Цветной реактив: к 30 мл рабочего раствора хлорного железа добавляют 20 мл воды, 1 мл 25 г/л раствора диацетилмонооксима и 0,25 мл 2,5 г/л раствора тиосемикарбазида. Цветной реактив готовят каждый раз перед употреблением.
Ход определения мочевины в сыворотке крови
Опытная проба: в центрифужную пробирку наливают 0,8 мл воды, 0,2 мл сыворотки и 1 мл 100 г/л раствора трихлоруксусной кислоты, смешивают. Через 15–20 мин центрифугируют. В чистую пробирку вносят 0,5 мл надосадочной жидкости и 5 мл цветного реактива. Пробирку выдерживают на кипящей водяной бане в течение 20 мин, затем охлаждают в течение 2–3 мин под проточной водой. Измерение проводят на фотометре при длине волны 530–560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы в кювете с толщиной слоя в 1 см. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но вместо надосадочной жидкости берут 0,5 мл воды.
Расчет проводят по формуле путем сравнения с калибровочной пробой. Калибровочную пробу ставят аналогично опытной, но вместо сыворотки берут 0,2 мл калибровочного раствора.
Концентрация мочевины, ммоль/л:
Еоп / Ек × Ск,
где Еоп – экстинкция опытной пробы;
Ек – экстинкция калибровочной пробы;
Ск – концентрация мочевины в калибровочном растворе, 7 ммоль/л.
Определение мочевины в моче проводят аналогично определению мочевины в сыворотке крови, но вместо сыворотки берут 0,2 мл разведенной мочи. Параллельно обрабатывают калибровочную пробу, как описано для определения мочевины в сыворотке крови.
Расчет мочевины на суточное количество мочи производят по следующей формуле:
Мсут = Ск × Еоп × а × К / Ек × б,
где Мсут – количество мочевины в суточной моче, ммоль;
Еоп – экстинкция опытной пробы;
Ек – экстинкция калибровочной пробы;
Ск – содержание мочевины в калибровочном растворе, ммоль;
а – суточное количество мочи, мл;
б – количество мочи, взятое на анализ, мл;
К – коэффициент разведения мочи.
Примечания
1. Измерение проводят не позже чем через 15 мин после охлаждения проб ввиду неустойчивости окраски.
2. Из-за неустойчивости окрашенного комплекса мочевины с диацетилмонооксимом и зависимости окраски от условий нагревания калибровочную пробу определяют параллельно каждой серии опыта.
3. При содержании мочевины в сыворотке крови выше 17 ммоль/л сыворотку разводят изотоническим раствором хлорида натрия, а результаты умножают на коэффициент разведения.
4. Для пересчета на азот мочевины результаты следует разделить на 2,14.
Принцип метода
Мочевина под действием уреазы разлагается на углекислый газ и аммиак, который в щелочной среде с гипохлоритом натрия и фенолом образует индофенол синего цвета (метод Бертло). Светопоглощение образовавшегося продукта пропорционально содержанию мочевины в образце.
Необходимые реактивы
1. Уреаза. Для определения пригодна уреаза с активностью > 5 МЕ/мг.
2. Этилендиамин-N, N, N’, N’-тетрауксусной кислоты динатриевая соль (трилон Б).
3. ЭДТА-буфер, 0,0269 моль/л, рН 6,5: 0,50 г трилона Б растворяют в 30–40 мл воды, доводят рН до 6,5 1 моль/л раствором едкого натра и доливают водой в мерной колбе до 50 мл.
4. Основной раствор уреазы в буфере, 10 МЕ/мл: 20 мг уреазы (активность 5 МЕ/мг) растворяют в 10 мл буфера. Навеску уреазы берут в зависимости от активности фермента. Раствор стабилен в течение месяца при хранении в холодильнике.
5. Рабочий раствор уреазы. Перед началом определения берут необходимое количество основного раствора уреазы и разводят бидистиллированной водой в отношении 1: 4.
6. Фенол.
7. Натрия нитропруссид 2-водный.
8. Цветной реактив: фенол – 0,11 моль/л, нитропруссид натрия – 0,18 моль/л: 0,0263 г нитропруссида натрия помещают в мерную колбу вместимостью 500 мл, приливают примерно 300 мл воды, растворяют при перемешивании. Затем добавляют 5,18 г фенола и доливают водой до метки. Реактив стабилен в течение месяца при хранении в холодильнике в посуде из темного стекла.
9. Натр едкий, 1 моль/л; 0,26 моль/л.
10. Гипохлорит натрия. Приготовление основного раствора гипохлорита: 100 г хлорной извести размешивают в течение 15 мин с 170 мл воды, после чего прибавляют при непрерывном помешивании раствор, состоящий из 170 мл воды и 70 г карбоната натрия. Масса сначала густеет, затем разжижается. Оставляют стоять до следующего дня. Надосадочную жидкость (гипохлорит натрия) сливают и фильтруют через промытый водой фильтр. Хранят в холодильнике в посуде из темного стекла. Определение активности хлора: 1 мл основного раствора гипохлорита натрия смешивают с 100 мл воды. К 50 мл этого раствора добавляют 5 мл свежеприготовленного 50 г/л раствора йодида калия и 10 мл 6 моль/л раствора НСl. Титруют 0,1 н раствором тиосульфата натрия (готовят из фиксанала). Как только раствор приобретает слабо-желтую окраску, добавляют 10 капель 1 %-ного раствора крахмала и титруют до обесцвечивания. Концентрацию гипохлорита натрия рассчитывают по хлору:
К = а × 0,709,
где К – концентрация активного хлора, г/100 мл гипохлорита натрия;
а – количество тиосульфата, пошедшего на титрование, мл;
0,709 – коэффициент пересчета 1 мл тиосульфата натрия в концентрацию хлора, г/100 мл.
11. Рабочий раствор гипохлорита натрия. После установления концентрации активного хлора основной раствор гипохлорита натрия разводят водой так, чтобы концентрация хлора составляла 0,78 г/л. Раствор гипохлорита с содержанием хлора 0,78 г/л смешивают с равным объемом 0,26 моль/ л раствором едкого натра (100 мл + 100 мл). Активность хлора проверяют не реже одного раза в 2 недели. Рабочий раствор содержит 0,011 моль/л гипохлорита и 0,13 моль/л едкого натра. Раствор хранят в холодильнике в посуде из темного стекла.
12. Мочевина.
13. Бензойная кислота, 2 г/л (кислоту растворяют при нагревании).
14. Калибровочный раствор мочевины, 0,5 ммоль/л: 15 мг мочевины растворяют в мерной колбе вместимостью 500 мл в 2 г/л растворе бензойной кислоты. Раствор стабилен при хранении в холодильнике.
15. Натрия хлорид, 0,154 моль/л.
Специальное оборудование
1. Спектрофотометр или колориметр с кюветой для микроизмерений.
2. Полуавтоматические микропипетки.
Ход определения
Перед определением сыворотку разводят 0,154 моль/л раствором хлорида натрия в отношении 1: 9.
Опытная проба: 100 мкл рабочего раствора уреазы вносят в пробирку, добавляют 20 мкл разведенной сыворотки. Закрывают пробкой, перемешивают и инкубируют в течение 15 мин при температуре 37 °C. После инкубации добавляют 300 мкл цветного реактива и 300 мкл рабочего раствора гипохлорита натрия. Перемешивают и инкубируют в течение 20–30 мин при температуре 37 °C. Измеряют экстинкцию в кювете с толщиной слоя в 1 см при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы. Окраска стабильна в течение нескольких часов.
Холостую пробу обрабатывают так же, как опытную, но вместо сыворотки берут 0,154 моль/л раствор NaCl.
Калибровочную пробу обрабатывают так же, как опытную, но вместо сыворотки берут калибровочный раствор мочевины. Измеряют при тех же условиях против холостой пробы.
Расчет количества мочевины в ммоль/л ведут по формуле:
Еоп / Ек × 0,5 × 10,
где Еоп – экстинкция опытной пробы;
Ек – экстинкция калибровочной пробы;
0,5 – концентрация мочевины в калибровочном растворе, ммоль/л;
10 – коэффициент разведения.
Линейная зависимость между оптической плотностью и концентрацией мочевины сохраняется до 33 ммоль/л.
Примечание
Объемы сыворотки и реактивов можно пропорционально увеличивать.
Содержание мочевины сыворотки крови – 2,5–8,3 ммоль/ л; мочевина суточной мочи – 333–583 ммоль/л.
Верхняя граница содержания мочевины в сыворотке крови зависит от приема белков с пищей. При приеме белков свыше 2,5 г/кг живой массы в сутки верхняя граница референтных величин содержания мочевины в сыворотке может быть повышена даже до 10 ммоль/л.
Клинико-диагностическое значение
При трактовке результатов анализа следует исходить из того, что диета с низким содержанием белка может уменьшить концентрацию мочевины, а избыточное питание азотистыми продуктами повышает уровень мочевины. Диета, бедная ионами хлора, также нередко приводит к повышению концентрации мочевины. Поэтому в большинстве случаев повышение концентрации мочевины до 12 ммоль/л считается физиологически допустимым. Однако существует мнение, что всякое повышение мочевины в крови выше 10 ммоль/л нужно рассматривать выходящим за пределы нормы, так как едва ли какой-либо пищевой режим способен поднять содержание мочевины крови выше этого уровня при отсутствии выделительных расстройств.
Из других физиологических состояний следует отметить беременность, при которой концентрация мочевины в крови часто падает ниже 4,5 ммоль/л.