L-лактат + НАД ↔ пируват + НАД Н + Н+.
Фермент широко распространен в организме человека. По степени убывания активности энзима органы и ткани могут быть расположены в следующем порядке: почки, сердце, скелетные мышцы, поджелудочная железа, селезенка, печень, легкие, сыворотка крови. В последней обнаружено несколько различных белков (изоэнзимов), обладающих каталитическими свойствами этого фермента.
Изменения в строении белковой части изофермента обусловливают их различные физико-химические свойства, что, в частности, сказывается в неодинаковой электрофоретической подвижности разновидностей этого фермента в агаровом, крахмальном, полиакриламидном и других гелях. В сыворотке крови обнаружены 5 изоэнзимов лактатдегидрогеназы: ЛДГ1, ЛДГ2, ЛДГ3, ЛДГ4, ЛДГ5, располагающихся в геле в порядке убывания их электрофоретической подвижности.
Установлено, что фракция ЛДГ1 происходит в основном из ткани сердца, ЛДГ5 – из печени.
В отличие от последней ЛДГ1 обладают большей устойчивостью к действию мочевины.
Лактатдегидрогеназа содержится не только в сыворотке, но и в значительном количестве в эритроцитах, поэтому сыворотка, используемая для анализа, должна быть свежей, лишенной следов гемолиза.
Исследование общей активности фермента характеризует интенсивность окислительно-восстановительных процессов организма, а определение активности отдельных изоэнзимов ЛДГ способствует диагностике некоторых заболеваний сердца, печени и других органов.
Принцип метода
Лактатдегидрогеназа (L-лактат; НАД-оксидоредуктаза) катализирует превращение лактата в пируват при одновременном восстановлении НАД в НАД(Н), который далее восстанавливает в присутствии N-метилфеназонийметилсульфата йоднитротетразолиевый фиолетовый в красный формазан.
Одновременно с определением общей каталитической активности лактатдегидрогеназы можно определять и долю фермента, устойчивого к действию мочевины, что характерно главным образом для изофермента сердечной фракции.
Пределы активности:
1) ЛДГ при температуре 37 °C – 0,66–2,66 мккат/л;
2) доля фермента, устойчивая к действию мочевины (%), – 60–80.
Необходимые реактивы
1. Молочная кислота 80 %-ная.
2. Натрия гидроокись, растворы 2 моль/л; 0,4 моль/л.
3. 0,45 моль/л раствор лактата натрия. В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 5 мл 80 %-ной молочной кислоты, добавляют 2 моль/л раствора едкого натра до получения рН 7,5 и доводят объем водой до метки. Хранят в посуде из темного стекла в холодильнике.
4. Натрия пирофосфат (Na4P2O7 × 10 Н2О).
5. НСl 1 моль/л.
6. Натрия пирофосфат 0,03 моль/л, рН 8,8: 6,69 г натрия пирофосфата растворяют в небольшом количестве воды, добавляют 1 моль/л раствор НСl до получения рН 8,8 и доводят объем водой до 500 мл. Стабилен в течение месяца при хранении в холодильнике.
7. НАД-окисленная форма. Готовят из Расчета 3 мг НАД на 1 мл воды. Раствор стабилен в течение 4 недель при хранении в холодильнике.
8. Раствор 2,4-динитрофенилгидразина: 19,8 мг 2,4-динитрофенилгидразина растворяют в небольшом количестве 1 моль/л раствора НСl при нагревании на водяной бане. После охлаждения доводят объем 1 моль/л раствором НСl до 100 мл. На следующий день реактив фильтруют. Раствор хранят в посуде из темного стекла. Стабилен в течение 1 года.
9. Пируват натрия (для построения калибровочной кривой): 11 мг кристаллического пирувата натрия растворяют в небольшом количестве бидистиллированной воды, переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой объем раствора до метки; 1 мл раствора содержит 88 мкг пировиноградной кислоты. Рабочий раствор готовят разведением основного раствора в 10 раз бидистиллированной водой; 1 мл рабочего раствора содержит 8,8 мкг пировиноградной кислоты.
Ход определения
Опытная проба: 0,1 мл сыворотки, разведенной 1: 2, смешивают с 0,3 мл раствора НАД, прогревают 5 мин при температуре 37 °C. Затем добавляют 0,8 мл 0,03 моль/л раствора пирофосфата натрия и 0,2 мл 0,45 моль/л раствора лактата натрия, предварительно прогретых при температуре 37 °C, и инкубируют смесь при температуре 37 °C в течение 15 мин. Тотчас после инкубации добавляют 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина, выдерживают 20 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 5 мл 0,4 моль/л раствора едкого натра, перемешивают и через 10 мин измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации.
Расчет активности производят по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика: из рабочего калибровочного раствора пирувата натрия готовят ряд разведений, как указано в таблице 19.
Таблица 19
Исследование активности лактатдегидрогеназы
Затем в пробирки приливают по 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина. Далее калибровочные пробы обрабатывают и измеряют так же, как опытные. Холостую пробу ставят так же, как калибровочную, но вместо калибровочного раствора добавляют воду. Линейная зависимость между концентрацией пировиноградной кислоты и оптической плотностью сохраняется от 0 до 3000 нмоль/(с × л).
Клинико-диагностическое значение
Активность лактатдегидрогеназы в сыворотке крови возрастает при повреждении миокарда, лейкозах, почечных заболеваниях, гемолитической, серповидно-клеточной анемиях, тромбоцитопениях, инфекционных мононуклеозах, а также прогрессивной мышечной дистрофии. Все заболевания, протекающие с некрозом тканей (инфаркт миокарда, некротические поражения почек, гепатиты, панкреатиты, опухоли), как правило, сопровождаются резким повышением активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови. При остром гепатите активность лактатдегидрогеназы в сыворотке крови повышена в первые недели желтушного периода, при легкой и среднетяжелой формах заболевания активность фермента возвращается к нормальному уровню довольно быстро. При заболеваниях печени процент мочевиностабильной фракции ЛДГ падает (< 20).
У больных инфарктом миокарда повышение активности фермента в сыворотке крови отмечается через 8–10 ч после начала приступа, достигая максимума через 24–28 ч. Активность остается повышенной на протяжении первой недели заболевания. К 8–9-му дню активность ЛДГ нормализуется. Активность сывороточной лактатдегидрогеназы при инфаркте миокарда дольше сохраняется повышенной, чем активность других ферментов. Ценность определения данного фермента особенно велика в неясных случаях заболевания, при нетипичной клинической и электрокардиографической картине. При стенокардии активность лактатдегидрогеназы в сыворотке крови не увеличивается. Инфаркт миокарда сопровождается возрастанием (> 40 %) мочевиностабильной фракции ЛДГ.
ЩФ – фосфогидролаза моноэфиров ортофосфорной кислоты, присутствует в каждом органе, больше всего вырабатывается в печени, костях, кишечнике, эндометрии (плаценте), легких. Активность фермента возрастает у детей в периоде быстрого роста, у женщин – в последнем триместре беременности, после менопаузы.
Располагается ЩФ на поверхности цитоплазматических мембран; наличие изоформ ЩФ в сыворотке крови связано с тем, что в организме человека биосинтез фермента кодируют 3 гена: печеночный, костный и почечный.
Принцип метода
Щелочная фосфатаза (щелочная фосфогидролипаза моноэстеров ортофосфорной кислоты) расщепляет в N-метил-D-глюкаминовом буфере 4-нитрофенилфосфат с образованием 4-нитрофенола и фосфата. Щелочная фосфатаза (ЩФ) активирована хлоридом натрия. Мерой каталитической концентрации фермента является количество освобожденного 4-нитрофенола, который определяют фотометрически, либо кинетическим методом, либо методом постоянного времени после остановки ферментативной реакции ингибитором ЩФ, который блокирует активный центр фермента.
Кинетическим методом можно без разведения анализировать сыворотки до каталитической концентрации ЩФ 30 мккат/л. Методом константного времени можно без разведения анализировать пробы до 7 мккат/л. При каталитической концентрации ЩФ, превышающей эти величины, пробы следует развести физиологическим раствором и анализ произвести повторно (результат умножить на разведение). Объемы отдельных растворов и пробы можно модифицировать при условии соблюдения взаимных соотношений объемов, указанных в описании хода инкубационной смеси.
Пределы активности ЩФ при температуре 37 °C (мккат/л):
1) мужчины – 0,90–2,29;
2) женщины – 0,74–2,10;
3) дети до 12 лет – 1,20–6,30.
Необходимые реактивы
1. п-нитрофениловый эфир фосфорной кислоты, динатриевая соль.
2. Соляная кислота, 0,001 моль/л.
3. п-нитрофенилфосфат натрия, 4 г/л раствор в 0,001 моль/л раствора НСl: 0,4 г п-нитрофенилфосфата помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доливают до метки 0,001 моль/ л раствором НСl. В связи с тем, что в продаже чаще имеется бариевая соль п-нитрофенилфосфата, то перевод ее в натриевую соль осуществляется следующим способом: к навеске п-нитрофенилфосфата бария, соответствующей получению 9 г/л раствора и помещенной в фарфоровую ступку, добавляют небольшими количествами 0,001 моль/л раствор НСl в процессе растирания соли в ступке в течение 10 мин. Добавлением насыщенного раствора сульфата натрия (1 мл на 100 мл раствора) бариевую соль переводят в натриевую.
Через 5 мин полученный раствор п-нитрофенилфосфата натрия фильтруют в делительную воронку, где затем взбалтывают с равным объемом водонасыщенного бутилового спирта. После разделения слоев жидкости в делительной воронке (вверху – бутанол, внизу – постепенно обесцвечивающийся субстратный раствор) бутанол выливают, а субстратный раствор подвергают описанной выше процедуре очистки еще 2–3 раза, пока он не станет совершенно бесцветным. После бутанола производят экстракцию водонасыщенным эфиром 1–2 раза. Реактив не должен содержать свободного