п-нитрофенола, отсутствие которого в субстратном растворе проверяется следующей пробой: к 1 мл субстратного раствора прибавляют 10 мл 0,02 моль/л раствора едкого натра и измеряют на ФЭКе при длине волны 400–420 нм (фиолетовый светофильтр). Экстинкция должна быть меньше 0,08; если экстинкция больше 0,08, необходимо удалить свободный п-нитрофенол. Для этого реактив экстрагируют 2 или 3 раза равными объемами бутилового спирта и один раз – эфиром. Затем удаляют следы эфира выдерживанием на воздухе. Бутиловый спирт и эфир должны иметь нейтральную реакцию. Если реактив не выдерживает указанный выше тест, то экстрагирование повторяют. Хранят раствор в холодильнике в замороженном состоянии в течение 2–3 недель.
4. Аминоуксусная кислота (гликокол, глицин).
5. Магния хлорид 6-водный.
6. Натр едкий; растворы 0,1 моль/л, 0,02 моль/л, не содержащие углекислого газа.
7. Буферный раствор – 0,05 моль/л глициновый буфер с добавлением катализатора хлорида магния – 95 мг/л: 375 мг глицина и 10 мг MgCl2 × 6Н2О растворяют в 42 мл 0,1 моль/л раствора едкого натра и доводят объем водой до 100 мл.
8. Субстратно-буферный раствор готовят смешиванием равных частей растворов 3 и 7, рН раствора 10,5. При смешивании 2 мл раствора с 10 мл 0,02 моль/л раствора едкого натра реактив не должен давать экстинкцию на ФЭКе более 0,1 (толщина слоя – 1 см, длина волны – 400–420 нм). В противном случае раствор не годится или подлежит реэкстрагированию бутанолом или эфиром. После экстракции необходимо снова установить рН. Хранят в холодильнике в течение 2–3 дней.
9. п-нитрофенол – калибровочный раствор 5 × 10–5 моль/ л: 696 мг п-нитрофенола растворяют в 0,02 моль/л растворе едкого натра и доводят этим же раствором объем до 1 л; 1 мл раствора содержит 5 мкмолей п-нитрофенола.
Ход определения
Опытная проба: в пробирки вносят по 1 мл субстратно-буферного раствора, прогревают при температуре 37 °C в течение 5 мин, затем добавляют по 0,1 мл сыворотки. Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют в течение 30 мин при температуре 37 °C. После инкубации пробирки переносят в водяную баню со льдом, а затем добавляют по 10 мл 0,02 моль/л раствора едкого натра и тщательно перемешивают. Через 5 мин пробы измеряют на ФЭК при длине волны 400–420 нм (фиолетовый светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 1 см против холостой пробы. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации.
Расчет производят по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика
Из рабочего калибровочного раствора готовят ряд разведений, как указано в таблице 20, и измеряют оптическую плотность растворов при условиях, аналогичных опытным, против 0,02 моль/л раствора едкого натра.
Таблица 20
Исследование активности щелочной фосфатазы
Клинико-диагностическое значение
Увеличение активности встречается при повышенном метаболизме в костной ткани: при заживлении переломов, при первичном и вторичном гиперпаратиреодизме (с явным вовлечением скелета), остеомаляции, недостатке витамина D в пище, заболеваниях костей.
Основные показатели биохимических исследований в состоянии нормы
В настоящее время действует форма справки на биохимический анализ крови № 228/у, утвержденная Минздравом СССР 04.10.1980 года. В нее включено 40 показателей крови. В большинстве случаев ограничиваются меньшим количеством показателей. Наиболее часто используемые на практике показатели приведены в таблице. Следует иметь в виду, что показатель нормы может варьироваться в зависимости от применяемого лабораторного метода.
Таблица 21
Основные показатели биохимического анализа
Биохимические анализаторы
Применение биохимических анализаторов позволяет быстро определить параметры биохимического состава крови. Помимо автоматических биохимических анализаторов, определяющих один параметр, существуют и работающие со спектром параметров. На рынке медицинского оборудования в настоящее время представлен широкий выбор анализатроов различного типа.
Основные параметры биохимических анализатоов:
1. Аналитические характеристики. Большинство моделей поддерживает возможность выполнения фотометрических и турбидиметрических исследований как «по конечной точке», так и в кинетическом режиме. В большинстве моделей также содержатся программы работы с нелинейными калибровками, верификация результатов по Вестгарду, возможность построения карт Леви-Дженнингса.
2. Тип анализатора: автоматический или полуавтоматический. При работе полуавтоматического анализатора оператор занимается смешиванием реактивов и заготовкой проб. Все остальные процессы, включая дозирование, исследование оптической плотности реагента, выполняются автоматически. Результаты исследования выводятся на экран и могут быть распечатаны или сохранены на цифровом носители. Полуавтоматические анализаторы невелики по габаритам и отличаются более низкой ценой. При работе с автоматическими анализаторами требуется минимальный контроль со стороны врача-лаборанта. Анализатор данного типа способствует экономии времени на исследования. Возможности автоматического анализатора: пипетирование, смешивание реагентов, доведение реагентов до требуемой температуры, проведение анализа, обработка данных. Задача оператора заключается в сведении данных и обработке емкостей.
3. Производительность. Нередко данный показатель выступает в качестве ключевых при выборе прибора. Тестирование осуществляется по монореагентным методикам двух типов: кинетические и по конечной точке. Анализаторы 1-го класса выполняют обработку данных кинетическим способом более медленно. Анализаторы 2-го и 3-го класса показывают равные по скорости результаты при работе с монореагентными методиками. При этом даже наиболее высокопроизводительные модели могут работать медленнее при выполнении биреагентных методик.
4. Тип системы в зависимости от применяемых реагентов: открытая и закрытая. Для работы анализаторам закрытого типа требуются исключительно фирменные реагенты производителя, обычно отличающиеся высокой стоимостью. Анализаторы открытого типа оборудованы светофильтрами, благодаря чему возможно проведение наиболее популярных методик с использованием наличествующих в лаборатории или свободном доступе реагентов.
5. Количество проб. От данного параметра зависит производительность лаборатории и оптимизация работы персонала. При отсутствии требуемых реагентов возникает необходимость остановки прибора, что снижает скорость работы. В состав наиболее компактных анализаторов входит от 10 до 15 загружаемых позиций, чего достаточно для выполнения среднего количества анализов. В работе крупной клиники или частной лаборатории может потребоваться 20–35 позиций для загрузки. Подобным требованиям отвечают анализаторы 2-го класса. При необходимости выполнить дополнительные исследования придется устанавливать дополнительные реактивы. Оптимальным выбором для подобных целей считаются анализаторы 2-го класса, включающие 35–40 позиций для реактивов. Анализаторы 3-го класса располагают 50–60 позициями, чего достаточно для установки практически любых реагентов. Некоторые модели анализаторов способны до начала работы самостоятельно определить и сигнализировать, на какое количество анализов хватит установленных реактивов.
6. Последовательность определения показателей крови:
– доступ Batch, или система «тест за тестом» – последовательное определение параметров исследования для каждого из образцов. Характерна для анализаторов с проточной кюветой. Данная система удобна для проведения научных исследований, поскольку практически отсутствует риск смешивания реактивов из наборов. Отрицательная сторона системы, особенно для лабораторий, занятых обслуживанием стационаров – невозможность быстрого получения исследований по каждому из пациентов;
– доступ Random Access, или свободный доступ – возможность работы в двух режимах. Режим «определение одного параметра во всех образцах» работает аналогично системе «тест за тестом». Режим «определение всех параметров для одного образца» позволяет провести исследование одного образца по всем требуемым показателям. При работе с данной системой неободимо правильно выстраивать очередность тестов, промывать оборудование между определенными видами анализов. Эта проблема решена в современных анализаторах: в них есть возможность ввести списки тестов, запрещенных в последовательной постановке.
7. Дополнительные характеристики:
– возможность управления и наличие меню на русском языке;
– количество потребляемой воды;
– возможность запуска срочной пробы;
– возможность охлаждения.
Виды биохимических анализаторов
Анализатор выдыхаемого водорода. Используется с целью измерения концентрации водорода (hydrogen (H2)) в образце выдыхаемого воздуха. Применяется для определения наличия анаэробных бактерий, связанных с нарушениями ЖКТ (желудочно-кишечный бактериальный гиперрост, обструкция, нарушение всасывания).
Анализатор выдыхаемого воздуха жидкостный сцинтилляционный. Автоматический анализатор. Применяется для количественного определения углерода С 14 (14С) или иного бета-излучателя в жидком растворе. Сфера применения: выявление наличия бактерии Helicobacter pylori. Работа прибора основана на применении жидкостно-сцинтилляционной методологии, призванной обнаруживать бета-излучающие 14C, освобожденые после гидролиза мочевины.
Анализатор гликированного гемоглобина (HbA1C). Применяется для количественного определения гликогемоглобина в клиническом образце. Принцип работы: технология разделения на основе разницы зарядов. Применяются методы ионобменной хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии, электрофореза. При работе прибора на основе химического анализа задействуются методы колориметрии, спектрофотометрии. При работе на основе разницы структур используются иммуноанализ и аффинная хроматография.