3) в 5 мл 1 н НСl. Раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой до метки. Для консервации добавляют 2 капли хлороформа. Одновременно готовят раствор соли магния 3 мг/мл, растворяя 2,5 г хлорида магния (MgCl2 × 6Н2О) в 100 мл воды. Из этих растворов готовят рабочие калибровочные растворы согласно таблице 26.
Таблица 26
Определение кальция по цветной реакции с крезолфталеинкомплексоном
Ход исследования
К 3 мл рабочего раствора крезолфталеинкомплексона добавляют 0,05 мл исследуемой сыворотки, перемешивают.
Через 5 мин фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 0,5 см при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) против рабочего раствора крезолфталеинкомплексона. Одновременно обязательно ставят хотя бы одну калибровочную пробу. Расчет ведут по калибровочной кривой либо по правилу пропорций.
Некоторые сорта стекла могут выщелачиваться, отдавая в раствор соли кальция, поэтому лабораторную посуду, особенно пробирки, желательно предварительно прокипятить в соляной кислоте. Определение желательно проводить в сыворотке или в плазме, полученной из гепаринизированной крови, так как щавелевая, лимонная кислоты и другие антикоагулянты, связывающие кальций, могут помешать определению.
Принцип метода
Глиоксаль-бис-2-оксианил образует с кальцием в щелочной среде окрашенный комплекс красного цвета, интенсивность которого пропорциональна концентрации кальция.
Необходимые реактивы
1. Метиловый спирт (метанол), безводный.
2. Глиоксаль-бис-2-оксианил (ГБОА), 0,05 %-ный раствор в метаноле, 50 мг препарата растворяют в 100 мл этанола (раствор нестойкий).
3. Боратный буфер рН 12,6 – растворяют в воде 10 г едкого натра (NaOH) и 10 г тетрагидробората натрия (Na2B4O7 × 10Н2О), объем доводят до 1 л в мерной колбе.
4. Ацетон.
5. Смесь метанола и ацетона 9: 1 (по объему).
6. Калибровочные растворы. Основной калибровочный раствор, содержащий 25 ммоль/л Са, готовят растворяя 100 мг карбоната кальция (СаСО3) в 5 мл 1 н НСl и доводя объем раствора до 100 мл водой в мерной колбе. Из этого раствора готовят рабочие калибровочные растворы с концентрацией 1,5–3,5 ммоль/л, отбирая 6–14 мл в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводя объем водой до метки (приготовление аналогично методу, описанному в предыдущем методе, но без солей магния).
Ход исследования
К 1,5 мл боратного буферного раствора прибавляют 0,02 мл исследуемой сыворотки и через l,5 мин 0,5 мл 0,05 %-ного раствора ГБОА в метаноле и еще через 1,5 мин 1 мл смеси метанола и ацетона. Фотометрируют точно через 5–10 мин после добавления 0,05 %-ного раствора ГБОА при длине волны 540–550 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см против холостой пробы, в которую вместо исследуемой сыворотки берут воду. Одновременно ставят также калибровочную пробу.
Расчет выполняют по калибровочному графику либо по правилам пропорции.
ГБОА в щелочной среде распадается с образованием анилина и глиоксаля, который затем окисляется в глиоксалевую кислоту, способную образовывать комплексы с кальцием. Даже в растворе абсолютного метанола на протяжении нескольких недель реактив разрушается. Накапливающаяся глиоксалевая кислота в значительно большей степени сказывается на экстинкции опытных, нежели калибровочных, проб. Поэтому измерение оптической плотности должно проводиться в совершенно определенное время, причем при длине волны 540–550 нм показания стабильнее, чем при длине 530 нм, при которой наблюдается максимум пика.
Принцип метода
Мурексид образует с кальцием в щелочной среде окрашенный комплекс, устойчивость которого повышается путем добавления в раствор глицерина.
Необходимые реактивы
1. Мурексидглицериновый реактив – 20 мг мурексида растворяют в 10 мл 4 н КОН, 1 мл этого раствора смешивают с 20 мл смеси из 10 мл воды и 10 мл глицерина.
2. Калибровочные растворы готовят так же, как и в предыдущем методе.
Ход исследования
В 0,3 мл воды вносят 0,1 мл исследуемой сыворотки, затем туда же добавляют 3 мл мурексидглицеринового реактива, перемешивают и через 5 мин фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волны 490 нм против холостой пробы, в которой вместо исследуемой сыворотки применяют воду. Одновременно ставят калибровочную пробу, в которую вместо сыворотки берут 0,1 мл калибровочного раствора.
Расчет производят по калибровочному графику.
Определение уровня ионизированного кальция
В современных газовых анализаторах имеется встроенный блок для определения концентрации ионизированного кальция.
Фосфор и фосфорсодержащие вещества
Фосфор находится в организме в форме неорганических фосфатов, в комплексе с липидами (липидный фосфор) и нуклеотидами (кислоторастворимый фосфор). Входит в состав скелета, фосфолипидов мембран, 2,3-дифосфоглицерата (вещества, определяющего способность гемоглобина присоединять кислород), участвует в процессах накопления и освобождения энергии в клетках (в составе АТФ, АДФ, АМФ), в ферментативных реакциях (в составе НАДФ). Поступает с пищей; всасывание в тонком кишечнике фосфора и кальция тесно связано и регулируется кальциферолом. Выведение с мочой зависит от функционального состояния почек.
Нормальная концентрация в крови: фосфор неорганический – 1–2 ммоль/л, фосфор липидный – 2,0–3,5 ммоль/л, в эритроцитах – 3–5 ммоль/л, фосфор кислоторастворимый (эритроциты) – 7–14 ммоль/л, в моче (неорганический фосфор) – 25,8–48,4 ммоль/сутки.
Определение концентрации фосфора в крови чаще всего назначается при нарушениях обмена кальция, так как наибольшее диагностическое значение имеет соотношение количества кальция и неорганического фосфора.
Увеличение концентрации отмечается при почечной недостаточности, передозировке витамина D, недостаточности паращитовидных желез, в некоторых случаях при миеломной болезни, нарушениях липидного обмена (липидный фосфор). Количество кислоторастворимого фосфора увеличивается при всех заболеваниях, сопровождающихся кислородной недостаточностью.
Снижение концентрации происходит при дефиците витамина D, первичном гиперпаратиреозе, диабетическом кетоацидозе, алиментарной недостаточности, респираторном алкалозе, болезни Крона, нарушениях всасывания в кишечнике, рахите, гиперфункции паращитовидных желез.
Унифицированный метод определения фосфора по восстановлению фосфорно-молибденовой гетерополикислоты
Принцип метода
Белки осаждают трихлоруксусной кислотой, в кислой среде фосфорная кислота образует с молибденовой кислотой фосфорно-молибденовую гетерополикислоту, которая восстанавливается эйконогеном с образованием ярко окрашенного молибденового синего.
Необходимые реактивы
1. Кислота трихлоруксусная, раствор 100 г/л (10 %-ный).
2. Кислота серная 5 н.
3. Аммоний молибденовокислый, 5 %-ный раствор готовят, растворяя 5 г (NH4)6Мо7О2 × 4Н2О в 100 мл 5 н серной кислоты.
4. Натрий кислый сернистокислый NaHSO3 (в такой форме соль существует только в растворе, это скорее коммерческое, нежели химическое название). При кристаллизации выпадает пиросернистокислый натрий (Na2S2O5), который называют также метабисульфитом. Все 3 названия – бисульфит, пиросульфит и метабисульфит – синонимы. Препараты с этими названиями могут быть с равным успехом использованы для определения фосфора.
5. Натрий сернистокислый безводный, сульфид натрия Na2SO3.
6. Эйконоген, раствор. Растворяют полностью 6 г бисульфита натрия в 20–25 мл воды, вносят в этот раствор 0,1 г эйконогена (аминонафтолсульфоновой кислоты), который также должен полностью раствориться, на что уходит некоторое время.
7. Отдельно в небольшом объеме растворяют 1,2 г безводного сернокислого натрия, оба раствора смешивают, доводят объем до 50 мл, дают отстояться несколько часов и фильтруют.
8. Калибровочный раствор. Основной калибровочный раствор, содержащий 50 ммоль фосфора в 1 л, готовят, растворяя 702,2 мг высушенного до постоянной массы при температуре 120 °C однозамещенного фосфата калия КН2РО4 в 100 мл воды. Из него готовят рабочие калибровочные растворы, содержащие 1, 2 и 3 ммоль/л. Для этого 1, 2 или 3 мл основного раствора доводят водой до объема 50 мл.
Ход исследования
К 1 мл прибавляют 4 мл воды и 5 мл раствора трихлоруксусной кислоты, через 10 мин центрифугируют или фильтруют. К 5 мл безбелкового фильтрата добавляют 1 мл раствора молибденовокислого аммония, 0,2 мл раствора эйконогена и 1,8 мл воды. Через 20 мин фотометрируют при длине волны 630–690 нм в кюветах с длиной оптического пути 1 см против холостого опыта. Одновременно ставят холостой опыт, в который вместо исследуемой сыворотки добавляют воду, и калибровочные опыты, в которые вместо сыворотки берут рабочие калибровочные растворы.
Расчет проводят по калибровочному графику или правилу пропорций.
Чувствительность метода можно значительно повысить, если после добавления эйконогена пробы нагревать в течение 7 мин на кипящей водяной бане и фотометрировать при длине волны 830 нм. В этом случае вместо 5 %-ного раствора молибденового аммония берут 0,5 %-ный раствор в 0,5 н серной кислоте, остальные реактивы те же. Согласно унифицированному методу окончательный объем фотометрируемых проб составляет 8 мл. Если объем кюветы меньше, все дозировки можно пропорционально уменьшить.