Ход исследования
К 2 мл исследуемой сыворотки прибавляют 2,5 мл воды и 1,5 мл 20 %-ного раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и ставят на 15 мин на водяную баню температурой 90–95 °C. Затем центрифугируют в течение 20 мин при скорости 2000 об./мин и отбирают 4 мл прозрачного слоя, к которым приливают 0,35 мл 70 %-ного раствора аммония ацетата и 0,3 мл раствора сульфата гидразина. Смесь фотометрируют при длине волны 535 нм в кюветах с длиной оптического пути 1 см, затем прибавляют 0,4 мл раствора сульфонированного батофенантролина, оставляют на 1 ч и снова фотометрируют при той же длине волны. Обе фотометрии выполняют против холостого опыта, в котором берут вместо исследуемой сыворотки 2 мл воды.
Калибровку проводят так же, как и основной опыт, но вместо сыворотки берут 2 мл калибровочного раствора.
Расчет сывороточного железа (мкмоль/л) выполняют по формуле:
Еоп1 – Еоп2 / Ек1 – Ек2 × 30,
где Еоп1 и Еоп2 – отсчеты опытной пробы до и после прибавления раствора сульфонированного батофенантролина;
Ек1 и Ек2 – соответственно результаты фотометрии калибровочной пробы;
30 – содержание железа в калибровочном растворе, мкмоль/л.
Надо тщательно следить за содержанием железа в дистиллированной воде и реактивах, используя в случае необходимости бидистиллированную воду, приготовленную в стеклянном перегонном аппарате. Если после удаления белков не удается набрать точно 4 мл надосадочной жидкости, можно взять меньшее ее количество и сделать поправку при Расчете или же взять точно такое же количество калибровочного раствора.
Принцип метода
Сывороточное железо восстанавливают тиогликолевой кислотой, белки осаждают трихлоруксусной кислотой, в фильтрате устанавливают нужную величину рН, добавляя ацетат натрия, и проводят цветную реакцию с батофенантролином. В связи с тем что он в воде не растворяется, используют спиртовой раствор.
Необходимые реактивы
1. Кислота тиогликолевая, кислота трихлоруксусная, раствор 400 г/л.
2. Натрия ацетат, насыщенный раствор (в случае необходимости его очищают от следов железа, растворяя 500 г в 1 л воды при 37 °C). К прозрачной надосадочной жидкости добавляют раствор батофенантролина из Расчета 10 мл на 1 л и этиловый спирт в количестве, равном количеству надосадочной жидкости; на холоде выпадают кристаллы СН3СООNа × 3Н2О.
3. Батофенантролин, 40 мг в 100 мл этанола.
4. НСl 1 н раствор.
5. Калибровочный раствор железа: 100 мг мягкой железной проволоки растворяют в 4 мл концентрированной НСl и разводят до 1 л водой, получается раствор, содержащий 100 мкг/мл. Из него разведением в 60 раз получают раствор, содержащий 30 мкмоль/л (1,67 мкг/л).
Учитывая, что метод определения очень чувствительный, необходимо принять все меры, чтобы реактивы и посуда не содержали железа, присутствие которого выявляется при постановке холостых проб. Посуду, в том числе пробирки для взятия крови, необходимо обрабатывать разбавленной НСl; должна использоваться только деионизированная или перегнанная в стеклянной посуде вода; реактивы очищаются перекристаллизацией.
Ход исследования
К 0,7 мл сыворотки прибавляют 2 капли тиогликолевой кислоты, взбалтывают, а затем еще 0,35 мл 1 н НСl, опять перемешивают и прибавляют 0,2 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Энергично размешивают стеклянной палочкой в течение 45 с, а затем центрифугируют при скорости 2500 об./мин. В пробирку с притертой пробкой отбирают из надосадочной жидкости 0,7 мл, к которым прибавляют 0,6 мл насыщенного раствора аммония ацетата и 0,7 мл раствора батофенантролина. Окраска развивается за 20–30 с. Фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волны 536 нм против холостой пробы, в которой вместо сыворотки берут 0,7 мл воды. Одновременно обрабатывают и калибровочную пробу, в которой вместо сыворотки используют 0,7 мл калибровочного раствора, содержащего 30 мкмоль железа в 1 л.
Расчет проводят по правилу пропорций.
Принцип метода
Исследуемую сыворотку выдерживают с раствором трехвалентного железа, при этом весь трансферрин насыщается. Избыток солей железа удаляют адсорбцией на карбонате магния и определяют содержание железа в надосадочной жидкости одним из приведенных выше методов.
Необходимые реактивы
1. Железо хлорное, 5 мг/мл: 2,42 г FeCl3 × 6H2O растворяют в 100 мл 0,005 н HCl.
2. Магния карбонат в порошке.
3. Все реактивы, необходимые для определения сывороточного железа одним из описанных выше методов.
Ход исследования
К 2 мл исследуемой сыворотки добавляют 4 мл раствора хлорного железа и тщательно перемешивают. Через 5 мин прибавляют порошок магния карбоната в объеме примерно 0,5 мл, встряхивают в течение 10–15 с и центрифугируют. В надосадочной жидкости определяют железо одним из описанных выше методов. Полученный результат умножают на 3 (разведение сыворотки).
Принцип метода
Моча минерализуется с серной кислотой, образовавшийся пирофосфат железа разрушается гидролизом на кипящей водяной бане, раствор нейтрализуется ацетатом аммония, железо восстанавливается сульфатом гидразина, и проводится цветная реакция с сульфонированным батофенантролином.
Необходимые реактивы
1. Кислота серная концентрированная.
2. Перекись водорода, 30 %-ный раствор в воде (пероксид).
3. Сульфат гидразина, насыщенный раствор: 2,5 г вещества заливают 100 мл воды.
4. Аммония ацетат, насыщенный раствор: к 148 г соли добавляют 100 мл воды.
5. Раствор сульфонированного батофенантролина.
6. Калибровочный раствор железа, содержащий 30 мкмоль/л.
Ход исследования
В колбу Кьельдаля помещают 5 мл исследуемой мочи и 1 мл концентрированной серной кислоты и нагревают на электрической плитке с закрытой спиралью или на песчаной бане; не должно быть бурного кипения и образования пены, которая поднималась бы в горлышко колбы. В конце сжигания должны образовываться тяжелые белые пары, занимающие нижнюю часть колбы. Когда материал потемнеет и объем его уменьшится примерно наполовину, добавляют несколько капель пергидроля, что способствует просветлению пробы. Сжигание проводят до тех пор, пока раствор не станет совсем светлым. После охлаждения доливают 10 мл воды и ставят на кипящую водяную баню на 5–10 мин, после чего объем пробы доводят водой до 20 мл. Отбирают 4 мл, к которым прибавляют 0,3 мл насыщенного раствора сульфата гидразина и 1,2 мл насыщенного раствора ацетата аммония, после чего фотометрируют при длине волны 535 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см, прибавляют 0,5 мл раствора сульфонированного батофенантролина и оставляют на 1 ч, затем повторно фотометрируют в тех же условиях.
В норме этим методом железо в моче не определяется.
Медь
Медь входит в состав ферментов, участвующих в процессах кроветворения, иммунных реакциях.
Нормальная концентрация в сыворотке крови – 11–24 мкмоль/л. 90–92 % этого количества связано с α2-глобулинами, в частности церулоплазмином, и менее 10 % находится в свободном состоянии.
Снижение концентрации меди в крови – характерный признак болезни Коновалова – Вильсона – наследственно обусловленного снижения синтеза (вплоть до полного прекращения) церулоплазмина и нарушения транспорта меди, приводящих к увеличению содержания меди в тканях, прежде всего в печени и головном мозге. При этом концентрация не связанной с церулоплазмином меди значительно увеличивается.
Повышение уровня церулоплазмина и соответственно меди в крови отмечается при многих заболеваниях, но не является для них информативным анализом. У рабочих медных рудников может развиваться профессиональный гиперкупреоз – избыточное содержание меди.
Йод
Йод – элемент, теснейшим образом связанный с тканью и функцией щитовидной железы. В организме содержится около 50 мг йода, 30–50 % которого находится в щитовидной железе. Скорость поглощения йода тканью железы пропорциональна ее функциональной активности. На этом основан широко используемый метод определения функционального состояния щитовидной железы по скорости поглощения радиоактивного йода.
Йод поступает с пищей, водой, поваренной солью.
Суточная потребность в йоде (мг/сутки): младенцы – 0,05–0,08; дошкольники – 0,10–0,12; школьники, подростки – 0,14–0,20; взрослые – 0,18–0,20; беременные, кормящие женщины – 0,23–0,26.
Однако и вода, и почва на большей части территории России не содержат достаточного количества йода, особенно горные и предгорные районы Северного Кавказа, Урала, Алтая, Сибири, Дальнего Востока. Центральноевропейская территория считается зоной легкой степени йодной недостаточности. Но даже при использовании йодированных пищевых добавок (йодированной соли, морской капусты и др.) организм может не получать необходимого количества йода из-за нарушения его всасывания при различных заболеваниях кишечника.
Нормальная концентрация в сыворотке крови – 0,67 ± ± 0,22 ммоль/л, белковосвязанный йод в составе тироксина (Т4) и трийодтиронина (Т3) – 0,32–0,63 ммоль/л.
Постоянно низкая концентрация йода в крови может приводить у взрослых людей к разрастанию (гипертрофии) щитовидной железы – зобу. Это заболевание нередко бывает эндемичным, т. е. характерным для определенных территорий с низким природным содержанием йода. Из-за недостатка йода может снижаться синтез гормонов щитовидной железы и развиваться гипотиреоз, который проявляется очень широким спектром признаков, так как тиреоидные гормоны оказывают влияние на общий обмен веществ, функции сердца, нервной системы и др. Особенно опасен дефицит йода в младенческом возрасте, так как приводит к развитию умственной недостаточности.