Обнаружение в моче белка Бенс-Джонса
Белок Бенс-Джонса может выделяться с мочой при миеломной болезни, макроглобулинемии Вальденстрема.
Исследование целесообразно проводить только при положительной пробе с сульфосалициловой кислотой. Индикаторная бумага для обнаружения белка Бенс-Джонса непригодна.
Принцип метода
Основан на реакции термопреципитации. Методы, с помощью которых оценивают растворение белка Бенс-Джонса при температуре 100 °C или повторное осаждение при последующем охлаждении, ненадежны, так как далеко не все белковые тела Бенс-Джонса обладают соответствующими свойствами. Наиболее достоверно выявление этого парапротеина осаждением его при температуре 40–60 °C, но и в этих условиях осаждение может не произойти в слишком кислой (рН < 3,0–3,5) или слишком щелочной (pH > 6,5) моче, при низкой относительной плотности мочи и при низкой концентрации белка Бенс-Джонса.
Необходимый реактив
2 М ацетатный буфер рН 4,9.
Ход исследования
Профильтрованную мочу в количестве 4 мл смешивают с 1 мл буфера и согревают в течение 15 мин на водяной бане при температуре 56 °C. При наличии белков Бенс-Джонса уже в течение 2 мин появляется выраженный осадок, при концентрации белка Бенс-Джонса менее 3 г/л проба может получиться отрицательной. На практике это встречается крайне редко, так как большей частью концентрация белка Бенс-Джонса в моче значительная.
С полной достоверностью белок Бенс-Джонса может быть обнаружен иммуноэлектрофоретическим исследованием при использовании специфических сывороток против тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов.
Определение альбумоз (протеоз)
Альбумозы – это продукты расщепления белков, принцип определения которых основан на том, что они не сворачиваются при кипячении, но дают положительную биуретовую реакцию и высаливаются некоторыми солями, особенно сульфатом аммония и ацетатом цинка в кислой среде.
Нормальная моча альбумоз не содержит. Следы могут быть в нормальной моче в случае примеси семенной жидкости. В патологии альбумозы могут встречаться в моче при лихорадочных состояниях, переливании крови и плазмы, рассасывании экссудатов и транссудатов, распаде опухолей.
Необходимые реактивы
1. Насыщенный раствор хлорида натрия.
2. Концентрированный раствор едкого натра.
3. Слабый раствор сульфата меди (почти бесцветный).
Ход исследования
К моче, подкисленной уксусной кислотой, прибавляют насыщенный раствор хлорида натрия (1/3 объема), кипятят и горячую жидкость фильтруют. Альбумозы проходят в фильтрат, в котором их присутствие определяют биуретовой реакцией. К фильтрату прибавляют 1/2 объема концентрированного раствора едкого натра и несколько капель слабого раствора сульфата меди. При положительной пробе получается красно-фиолетовое окрашивание.
При положительной пробе с сульфосалициловой кислотой мочу нагревают. Если муть исчезает и вновь появляется при охлаждении, это означает, что моча содержит альбумозы или белковое тело Бенс-Джонса.
Нормальную концентрацию глюкозы в моче (до 0,2 г/л) обычными пробами не обнаруживают. Появление глюкозы в моче может быть результатом физиологической гипергликемии (алиментарной, эмоциональной, лекарственной) и патологических изменений в организме.
Физиологическая глюкозурия наблюдается при введении с пищей большого количества углеводов (алиментарная), после эмоционального напряжения (эмоциональная глюкозурия), после приема некоторых лекарств (диуретина, кофеина, кортикостероидов), при отравлениях (морфином, хлороформом, фосфором). Реже наблюдается почечная (ренальная) глюкозурия, обусловленная повышенной проницаемостью почек в отношении глюкозы и появлением ее в моче при нормальном количестве сахара в крови.
Появление глюкозы в моче зависит от концентрации ее в крови, от процесса фильтрации в клубочках (гломерулярных клиренсов) и от реабсорбции глюкозы в канальцах нефрона. Патологические глюкозурии делятся на панкреатогенные и внепанкреатические. Важнейшая из панкреатогенных – диабетическая глюкозурия. Внепанкреатические глюкозурии наблюдаются при раздражении ЦНС, гипертиреозе, синдроме Иценко – Кушинга, патологии печени, почек.
Для правильной оценки глюкозурии (особенно у больных диабетом) необходимо исследовать на сахар мочу, собранную за сутки.
Унифицированный метод определения с помощью индикаторных полосок
Метод основан на специфическом окислении глюкозы с помощью фермента глюкозооксидазы; образовавшаяся при этом перекись водорода разлагается пероксидазой и окисляет краситель. Изменение окраски красителя при окислении свидетельствует о присутствии глюкозы в моче.
Реактивная бумага «Глюкотест» представляет собой полоски бумаги 0,5 × 5 см, имеющие поперечную полосу светло-желтого цвета, пропитанную раствором ферментов и красителя. С помощью бумаги «Глюкотест» можно обнаружить глюкозу в моче и ориентировочно определить ее концентрацию.
Ход исследования
Индикаторную бумагу погружают в исследуемую мочу, так чтобы желтая полоса с реактивами оказалась смоченной, после этого ее немедленно извлекают из мочи и на 2 мин оставляют на пластмассовой пластинке. По истечении 2 мин сразу же сравнивают изменившуюся окраску цветной полосы на бумаге со шкалой, имеющейся в комплекте.
Содержание глюкозы в моче определяют по наиболее совпадающему со шкалой цвету полоски.
Полоски хранят при температуре от +8 до +18 °C, избегая попадания на них прямых солнечных лучей; не рекомендуется дотрагиваться рукой до цветной шкалы полоски.
Исследуют свежесобранную мочу; при содержании в моче глюкозы более 20 г/л интенсивность окраски цветной полосы становится предельной (соответствует 2 % по шкале) и далее не меняется.
Проба Гайнеса
Можно использовать готовый набор реактивов.
Метод основан на способности глюкозы восстанавливать в щелочной среде при нагревании гидрат окиси меди (синего цвета) в гидрат закиси меди (желтого цвета) и закись меди (красного цвета).
Для того чтобы из гидрата окиси меди при нагревании не образовался черный осадок окиси меди, к реактиву добавляют глицерин, гидроксильные группы которого связывают гидрат окиси меди.
Необходимые реактивы
1. Реактив Гайнеса: 13,3 г кристаллического сульфата меди (СuSO4 × 5Н2О) растворяют в 400 мл дистиллированной воды.
2. 50 г едкого натра растворяют в 400 мл дистиллированной воды.
3. 15 г глицерина растворяют в 200 мл дистиллированной воды. Далее первый и второй растворы смешивают и тотчас же приливают третий раствор. Реактив стоек.
Ход исследования
К 6–8 мл мочи прибавляют 20 капель реактива до появления голубоватой окраски, смешивают и нагревают верхнюю часть пробирки до начала кипения. Нижняя часть пробирки – контроль. При наличии глюкозы в моче появляется желтая окраска в верхней части пробирки.
При бактериурии глюкоза мочи быстро разлагается.
Проба Бенедикта
Реакция основана на свойстве глюкозы восстанавливать гидрат окиси меди в щелочной среде в гидрат закиси меди (желтый цвет) или закись меди (красный цвет).
Необходимые реактивы
1. В однолитровую мерную колбу наливают 700 мл воды, добавляют 173 г цитрата натрия, 100 г безводного (или 200 г кристаллического) карбоната натрия. Нагревают до растворения.
2. Отдельно растворяют 17,3 г сульфата меди в 100 мл воды.
Смешивают оба раствора, непрерывно взбалтывая, после охлаждения доливают водой до 1 л.
Ход исследования
В пробирку наливают 5 мл реактива и прибавляют 8–10 капель мочи. Пробу нагревают в течение 2 мин на пламени или 5 мин в кипящей водяной бане. Дают пробирке остыть в течение 5–7 мин. При наличии сахара появляется зеленая, желтая или красная окраска жидкости с осадком. При зеленой окраске без наличия осадка проба считается отрицательной.
Проба Бенедикта является самой надежной, так как при большом разведении мочи (8–10 капель мочи на 5 мл реактива) восстанавливающее действие других редуцирующих веществ мочи выражено слабо.
Проба Нилендера
Проба основана на восстановлении глюкозой нитрата висмута в металлический.
Необходимый реактив
2 г нитрата висмута растирают в ступке с 4 г сегнетовой соли, растворяют в 100 мл 10 %-ного едкого натра и фильтруют. Реактив бесцветный. Хранят в бутылке из темного стекла.
Ход исследования
К моче прибавляют реактив в соотношении 2: 1 и кипятят в течение 3 мин. В присутствии сахара появляется окраска от коричневой до черной, при стоянии образуется темный осадок. Эта проба чаще, чем другие, оказывается положительной при отсутствии сахара в моче. Положительный результат получается в присутствии других редуцирующих веществ, находящихся в моче (такие как белок, лекарственные вещества: антипирин, салициловая кислота, антибиотики – биомицин, тетрациклин).
Унифицированный поляриметрический метод определения содержания глюкозы
Метод основан на использовании свойства раствора глюкозы вращать плоскость поляризованного луча вправо. Угол вращения пропорционален концентрации глюкозы в растворе.
Необходимый реактив
30 %-ный раствор ацетата свинца.
Специальное оборудование – поляриметр.
Ход исследования
Исследуемая моча должна быть кислой реакции, прозрачной и не содержать белка. Белок удаляют кипячением с последующим фильтрованием. Необходимо также обесцветить мочу, так как некоторые пигменты могут быть оптически активны. Лучше всего обесцвечивание достигается обработкой ацетатом свинца, для этого к 10 мл мочи приливают 1 мл 30 %-ного ацетата свинца, подкисленного несколькими каплями уксусной кислоты (в щелочной среде свинец осаждает глюкозу), перемешивают, фильтруют. Исследовать можно только прозрачный фильтр. Затем трубку поляриметра наполняют прозрачным фильтратом, избегая попадания пузырьков воздуха, накрывают шлифованным с