1) слабая – 1+;
2) заметная опалесценция – 2+;
3) умеренное помутнение – 3+;
4) значительное помутнение – 4+.
Унифицированный метод определения глобулинов высаживанием (реакция Апельда)
Реакция основана на свойстве солей в определенной концентрации осаждать избирательно глобулины.
Необходимый реактив
Насыщенный раствор сульфата аммония – 85 г соли – растворяют в 100 мл воды. Полученный раствор выдерживают 48 ч при комнатной температуре и после фильтрования употребляют для постановки реакции. Реакция раствора нейтральная.
Ход исследования
В пробирку вносят 0,5 мл ликвора, приливают 0,5 мл реактива и перемешивают. В контрольную пробирку наливают 1 мл воды.
Оценка результатов
Оценку проводят в течение 3 мин после смешивания ликвора с реактивом. Сравнение опыта с контролем производят на темном фоне. Для выражения результатов пользуются системой 4 плюсов:
1) значительное помутнение – + + + +;
2) умеренное – + + +;
3) заметная опалесценция – + +;
4) слабая опалесценция – +.
Клиническое значение
Реакция дает относительное представление о нормальном и патологическом содержании глобулинов. Слабая опалесценция (+) свойственна и нормальной спинномозговой жидкости при небольшом повышении общего белка (больше 0,2 г/л). Наиболее достоверное представление о содержании глобулинов можно получить при электрофоретическом обследовании ликвора, которое целесообразно проводить при положительной реакции Апельда.
Унифицированная реакция с хлорным золотом (реакция Ломге)
Коллоидные растворы, не изменяющиеся под влиянием различных разведений нормальной спинномозговой жидкости, в патологически измененной жидкости меняют степень дисперсности в зависимости от разведения жидкости, при этом изменяются цвет, растворимость и может выпадать осадок.
Необходимые реактивы
1. 1 %-ный водный раствор чистого хлорного золота.
2. Хлорид натрия, 4,5 г на 1 л воды.
3. Цитрат натрия, 1 %-ный раствор в воде.
4. Рабочий раствор хлорного золота.
Готовят следующим образом: к 95 мл воды приливают 1 мл 1%-ного хлорного золота, нагревают до 90–95 °C.
К рабочему раствору прибавляют 5 мл до появления вишнево-красного окрашивания. В процессе кипячения окраска раствора меняется, переходя из синей в фиолетовую, затем красную и вишневую. Раствор может храниться в темном месте до 2 месяцев.
Ход исследования
Готовят разведения спинномозговой жидкости. Берут 11 пробирок, в первую наливают 0,9 мл, а в остальные – по 0,5 мл 0,45 %-ного раствора хлорида натрия. В первую наливают 0,1 мм спинномозговой жидкости и после перемешивания переносят 0,5 мл во 2-ю пробирку, из последней 0,5 мл смеси удаляют. Таким образом исключают серию разведений от 1: 10 до 1: 5120. В 11-ю пробирку спинномозговую жидкость не добавляют, она является контрольной. Во все пробирки добавляют до 2,5 мл рабочего раствора хлорида натрия. После энергичного встряхивания пробирок их оставляют на 16–18 ч при комнатной температуре.
Оценка полученных результатов. Если спинномозговая жидкость нормальная, смесь всех 11 пробирок остается пурпурно-красной или в одной из первых пробирок фиолетово-пурпурной. При патологическом ликворе на дне пробирок появляется осадок, а цвет жидкости меняется. Изменение цвета принято регистрировать цифрами:
0 – отсутствие окраски;
1 – красно-фиолетовый цвет;
2 – фиолетовый;
3 – красно-синий;
4 – синий;
5 – светло-синий и голубой;
6 – бесцветный.
Цифровое выражение по пробиркам: отрицательная реакция – 00 000 000 000; дегенеративная кривая – 666 654 320; воспалительная – 00 124 566 530.
Клиническое значение
При изменении альбумино-глобулинового коэффициента происходит изменение коллоидной реакции. Воспалительный тип реакции Ломге наблюдается при повышенном содержании α- и β-глобулинов, дегенеративный тип реакции бывает за счет увеличения мелкодисперсной фракции белка – альбуминов и снижения содержания глобулинов.
Большое значение имеют глобулиновые реакции при дифференциальной диагностике органических и функциональных нарушений, при неврастении, прогрессивном параличе и латентном сифилисе.
Определение крови в спинномозговой жидкости
Количественное определение крови
Метод основан на сравнении уровня гемоглобина в периферической крови и спинномозговой жидкости. М. М. Гунеф использовал для определения гемоглобина в ликворе 0,04 %-ный раствор аммиака.
Ход определения
5 мл геморрагической спинномозговой жидкости центрифугируют в течение 10 мин, осадок растворяют в 5 мл 0,4 %-ного раствора аммиака, можно брать и меньше, важно, чтобы количество жидкости и раствора аммиака было одинаковым. Кровь из пальца в количестве 20 мл смешивают с 5 мл 0,4 %-ного раствора аммиака.
Концентрацию гемоглобина определяют на аппарате при длине волны 542.
Биохимические методы исследования
Определение глюкозы в спинномозговой жидкости осуществляется с помощью цветной реакции или на биохимическом анализаторе так же, как и в крови. В норме в ликворе содержится глюкоза в пределах 2,8–3,9 ммоль/л. При остром и подостром серозном менингите содержание глюкозы увеличивается. Увеличение ее содержания в ликворе при нормальном содержании в крови наблюдается при явлениях раздражения оболочек мозга.
Определение содержания глюкозы в спинномозговой жидкости должно проводиться с исследованием сахара крови.
Унифицированный газооксидазный метод по окислению ортотолуидина
Глюкозооксидаза окисляет глюкозу с образованием перекиси водорода, которая под действием пероксидазы окисляет ортотолуидин с образованием синего хромогена. Обе реакции протекают одновременно при рН 4,8.
Необходимые реактивы
1. Натрия хлорид – 9 г/л (изотонический раствор). Готовят, растворяя 0,9 г NaCl в 100 мл жидкости.
2. Цинка сульфат – 50 г/л, 5 г сульфата цинка (ZnSO4) растворяют в воде, объем доводят до 100 мл.
3. Натр едкий – 0,3 ммоль/л готовят, растворяя в воде, доводят до 100 мл.
4. Натр едкий – 0,3 ммоль/л готовят, растворяя 1,2 г NaOH в 100 мл воды, концентрацию проверяют титрованием.
5. Ортотолуидина 1 %-ный раствор: 1 г препарата растворяют в 100 мл 96 %-ного спирта. Раствор можно хранить в холодильнике в склянке с притертой пробкой в течение нескольких месяцев.
6. Ацетатный буферный раствор pH 4,8: смешивают 4 части 0,25 г уксусной кислоты и 6 частей 0,25 %-ного ацетата натрия.
7. Глюкозооксидаза. Сухой препарат активностью 3000 ЕД/мг или больше.
8. Пероксидаза из крови – 1 мл растворяют в 5 мл ацетатного буфера.
9. Рабочий реактив: в 80 мм ацетатного буфера растворяют 2 мг глюкозооксидазы и 1 мг пероксидазы, прибавляют 1 мл 1%-ного раствора ортотолуидина и доводят объем буферным раствором до 100 мл. Рабочий реактив должен быть прозрачным, бесцветным или иметь слабо-зеленый оттенок, в этом случае он устойчив при хранении на холоде. Если же окраска интенсивная или спустя несколько часов после хранения начинает выпадать осадок, это значит, что ортотолуидин недостаточно чистый и его надо перекристаллизовать.
10. Калибровочные растворы глюкозы. Глюкозу предварительно высушивают при 37 °C и хранят в эксикаторе. Сначала готовят основной раствор с концентрацией 50 ммоль/л, для чего 180 мл вещества растворяют в 20 мл насыщенного раствора 0,3 %-ной бензойной кислоты. Из этого раствора готовят рабочие калибровочные растворы, содержащие 3; 6; 9; 12; 15; 18 и 21 ммоль/л. Для этого берут 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3; 3,6 и 4,2 мл основного раствора и доводят насыщение раствором до 10 мл.
Ход определения
В центрифужные пробирки вносят 1,1 мл сульфата цинка и 0,4 мл 0,3 %-ного раствора NaOH, перемешивают. При этом образуется тонкий гель гидрата окиси цинка, в него впускают 0,1 мл спинномозговой жидкости, снова перемешивают и в течение 10 мин центрифугируют. К 1 мл надосадочной жидкости добавляют 3 мл рабочего реактива и осторожно перемешивают. Постепенно развивается окрашивание, которое возникает максимум через 13–15 мин, а затем постепенно уменьшается. Фотометрируют через один и тот же промежуток времени после добавления рабочего реактива в кюветах с длиной оптического пути 1 см, длина волны 625 нм холостого опыта. При приготовлении калибровочного графика вместо проб крови берут 0,1 мл соответствующего калибровочного раствора. Расчет можно проводить по калибровочному графику, для построения которого на одной оси откладывают концентрацию глюкозы (моль/л), а на другой – величины экстинкции.
Определение хлоридов может осуществляться методом титрования или на электролитном анализаторе.
Пониженное содержание хлоридов в ликворе характерно для менингита, особенно туберкулезного, при бруцеллезе, повышенное – при опухолях мозга, абсцессах мозга, эхинококкозе.
Имеет небольшое диагностическое значение.
Определение гликопротеинов и липопротеинов спинномозговой жидкости производят с помощью электрофореза на бумаге с предварительным сгущением жидкости.
Для диагностики туберкулеза используются триптофановая реакция с 2 %-ным формалином, 0,06 %-ным раствором цитрата натрия и концентрированная соляная кислота.
Необходимые реактивы
1. 2 %-ный водный раствор формалина (1 часть формалина и 19 частей дистиллированной воды).
2. 20,6 %-ный раствор азотистого натрия (NaNO2), готовится ex tempera из 0,6 %-ного раствора (1 часть его и 9 частей дистиллированной воды).
3. Концентрированная соляная кислота.
Ход определения