Инвазии людей паразитическими червями распространены довольно широко.
Важнейшим звеном всей работы служит гельминтологическая диагностика. Для постановки диагноза гельминтозов исследуют испражнения, дуоденальное содержимое, мокроту, мочу, содержимое кист, кровь, перианальную и ректальную слизь, содержимое подногтевых пространств.
В клинической лаборатории чаще всего подвергают исследованию кал. Для анализа достаточно иметь небольшое количество материала. В кале можно обнаружить сами гельминты, их фрагменты или яйца.
В кале встречаются яйца следующих гельминтов:
– из нематод (круглых червей) – аскарид, власоглава, томикса, кривоголовки двенадцатиперстной, некатора, трихостронгилиды;
– из трематод – двуустки печеночной, двуустки кошачьей, двуустки ланцетовидной, шистосомы;
– из ленточных червей – цепня невооруженного, цепня вооруженного, лентеца широкого, лентеца малого.
В лабораторию должны доставляться свежие (менее суточной давности) испражнения (разовая порция) в чистой стеклянной посуде. Для контроля лечения направляют все порции фекалий, выделенные в дни приема антигельминтного средства.
Кал прежде всего должен быть подвергнут макроскопическому осмотру. При этом могут быть выявлены целые экземпляры паразитов и их фрагменты (части, стробилы, членики).
Для яиц гельминтов характерна четкая морфологическая структура. Все они имеют оболочку определенного строения, что отличает их от других образований, попадающих в кал.
Яйца каждого вида гельминтов имеют свои постоянные размеры и могут содержать яйцеклетку, развитые личинки или желточные клетки.
Макрогельминтологические исследования
Макроскопическое исследование служит для обнаружения в кале целых гельминтов и их фрагментов невооруженным глазом или с помощью ручной лупы.
Приготовление препарата
Для исследования испражнения смешивают с водой до жидкой консистенции и переносят небольшими порциями в чашку Петри, тщательно осматривая на черном фоне. Пинцетом или препаровальными иглами извлекают все похожие на фрагменты гельминтов белые частицы.
Крупные образования помещают между двумя предметными стеклами и рассматривают под лупой. Более удобен для этой цели способ отстаивания (отмучивания). Собранные фекалии помещают в высокие стеклянные цилиндры, банки (можно в ведро), смешивают с 5–10-кратным количеством воды и дают отстояться. Мутный слой над осадком сливают, снова заливают водой, перемешивают, отстаивают и воду снова сливают. Эту процедуру повторяют, пока вода над осадком не станет прозрачной, затем воду сливают и просматривают осадок в черной или прозрачной кювете на черном фоне.
Дифференцировать отдельные виды гельминтов можно с учетом их анатомоморфологических признаков. Так, определить вид нематод можно только по целым экземплярам, реже по крупным фрагментам.
Распознавание нематод не представляет затруднений; их рассматривают невооруженным глазом или под лупой.
Цестоды можно диагностировать по зрелым членикам, сколексам. Определение вида ленточных червей по членику производят следующим образом. Обнаруженный в испражнениях членик отмывают в воде, помещают на предметное стекло, покрывают другим предметным стеклом и при легком надавливании на край препарата рассматривают на свет. Отмечают форму членика (узкий, длинный характерен для тениид, плоский, короткий – для лентеца широкого), строение матки.
Распознавание крупных цестод по их сколексам производят после дегельминтизации. Отмытого паразита осматривают, отыскивают его тонкий конец. Обнаружив головку, рассматривают ее строение с помощью лупы или под малым увеличением микроскопа. Определение трематод осуществляют только после дегельминтизации на основании особенностей формы, размера, внутреннего строения (расположения семенников и т. д.).
Микрогельминтологические исследования
Изучению подвергают нативные препараты и препараты после специальной обработки.
Самый простой и удобный метод исследования испражнений – метод мазка. Нативный мазок готовят с 50%-ным раствором глицерина. Для этого деревянной палочкой из разных мест доставленного кала берут частицу величиной со спичечную головку и готовят несколько препаратов.
Кал тщательно растирают на предметном стекле с несколькими каплями 50%-ного раствора глицерина до получения достаточно равномерного и прозрачного мазка, который занимает почти всю поверхность стекла. Микроскопируют мазок, не применяя покровных стекол. Раствор глицерина хорошо осветляет препарат и предохраняет его от высыхания. При отсутствии глицерина препарат можно готовить с изотоническим раствором хлорида натрия или водой. Вероятность обнаружения яиц гельминтов увеличивается при применении метода толстого мазка.
Метод «толстого мазка с целлофаном» (по Като) применяется для диагностики аскаридоза, трихоцефалеза, анкилостомидоза (для последнего он особенно ценен). Яйца гельминтов обнаруживают в толстом мазке фекалий, осветленных глицерином и подкрашенных малахитовой зеленью. Для этого используют 3%-ный водный раствор малахитовой зелени, глицерин, 6%-ный водный раствор фенола.
Из этих компонентов готовят смесь Като: 6 мл раствора малахитовой зелени, 500 мл глицерина и 500 мл раствора фенола смешивают и хранят в закрытой посуде при комнатной температуре. Раствор стабилен, его используют при приготовлении пластинок по Като. Для приготовления их из целлофана нарезают прямоугольные пластинки размером 20 × 40 мм и погружают их в смесь Като на 24 ч, после чего они готовы к употреблению. Хранят готовые пластинки в смеси Като, в хорошо закрытой посуде при комнатной температуре.
Кусочек фекалий величиной с горошину наносят на предметное стекло, покрывают пластинкой по Като и придавливают резиновой пробкой так, чтобы фекалии размазались по стеклу в пределах пластинки. Мазок оставляют при комнатной температуре для осветления на 30–40 мин. Затем рассматривают под микроскопом.
Достоинствами метода являются его простота, гигиеничность, возможность просмотреть большое количество фекалий, что повышает вероятность выявления яиц. Описанным методом можно выявить яйца нематод и цестод.
Фасциола (Fasciola hepatica). Яйцо правильной овальной удлиненной формы. Оболочка гладкая, тонкая, желтого цвета с крышечкой на одном полюсе и плоским бугорком на другом. Оно заполнено множеством желточных клеток. Размеры 130 × 145 × 70–90 мкм.
Ниже представлена сравнительная характеристика гельминтов (табл. 41, 42, 43).
Описторхис (Opisthorchis felineus). Яйцо овальное, вытянутой формы, слегка асимметрично. Оболочка гладкая, тонкая, светло-желтого цвета. На одном полюсе имеется слабо различимая крышечка, на противоположном – бугорок. Внутри яйца содержится развитая личинка (микроцидий). Размеры 26–32 × 11–14 мкм.
Лентец широкий (Dyphyllobothrium latum). Яйцо овальное желтоватого цвета. Оболочка гладкая, прозрачная, толстая. На верхнем полюсе хорошо просматривается крышечка, на противоположном – бугорок. Внутри яйца многочисленные желточные клетки. Размер 68–71 × 45 мкм.
Вооруженный цепень (Taenia solium) и невооруженный цепень (Taeniarhynchus saginatus). Яйца округлые или слегка овальные с толстой коричневой радиально исчерченной оболочкой. Внутри яйца видна онкосфера (зародыш) с тремя парами крючьев. Яйца обоих видов неразличимы. Размер 31 × 40 мкм.
Карликовый цепень (Hymenolepis nana). Яйцо эллипсовидной формы. Оболочка бесцветная с онкосферой внутри. Онкосфера имеет 3 слоя оболочки темно-коричневого цвета. Хорошо заметны 3 пары эмбриональных крючьев. Размер 40 × 50 мкм.
Власоглав (Trichocephalus trichiurus). Яйцо имеет форму лимона. Оболочка толстая, многослойная, золотисто-желтого или коричневого цвета. На полюсах имеются бесцветные пробковидные образования. Размер 50–54 × 22–23 мкм.
Анкилостома (Ancylostoma duodenale). Яйцо овальной формы с закругленными полюсами. Оболочка тонкая, прозрачная, бесцветная. В свежеотложенном яйце хорошо различимы 4 бластомера. Размер 54–70 × 36–40 мкм.
Аскарида (Ascaris lumbricoides). Оплодотворенное яйцо овальной формы, имеет толстую, многослойную оболочку. Наружная оболочка белковая, крупнобугристая, желто-коричневого цвета. Некоторые яйца бывают лишены белковой оболочки.
Яйцо бесцветное или с серо-зеленым оттенком. Размер 50–106 × 40–50 мкм.
Острица (Enterobius vermicularis). Яйцо овальное, асимметричной формы, одна сторона выпуклая, другая утолщена. Оболочка гладкая, бесцветная, многослойная. Внутри яйца зародыш на разных стадиях развития. Размер 50–60 × 20–30 мкм.
Таблица 41
Сравнительная характеристика яиц трематод
Таблица 42
Сравнительные данные о ленточных червях
Таблица 43
Сравнительная характеристика яиц нематод
Методы обогащения
Кроме метода мазков, применяют более сложные, но и более эффективные методы – методы обогащения, основанные на концентрации яиц в препаратах. Эти методы условно можно разделить на 2 большие группы:
1) концентрация яиц на поверхности жидкости (методы флотации, всплывания);
2) концентрация яиц в осадке (методы осаждения, седиментации).
Метод Калантарян (с флотационным раствором). Основан на том, что в жидкости с высокой относительной плотностью яйца гельминтов как более легкие всплывают на поверхность, где и концентрируются.
Для этого используется раствор Калантарян (1 кг нитрата натрия растворяют в 1 л воды; смесь кипятят до образования пленки, остужают; относительная плотность раствора 1,38).
В химическом стакане тщательно размешивают стеклянной палочкой 5–10 г фекалий со 100–200 мл флотационного раствора. Сразу после размешивания удаляют всплывшие на поверхность крупные частицы. Стаканчик покрывают предметным стеклом так, чтобы оно соприкасалось с поверхностью жидкости.
Если жидкости мало, ее следует долить до полного соприкосновения смеси с предметным стеклом. Оставляют для всплытия яиц на 20–30 мин, после чего предметное стекло снимают, кладут под микроскоп и просматривают без покровного стекла.
Хорошо всплывают все яйца, в том числе трематод, крупных цестод, а также неоплодотворенные яйца аскарид, яйца власоглава.
Метод Фюллеборна позволяет исследовать большое количество материала и широко используется.
В небольшую баночку (обычно мазевую) помещают 5 г фекалий и тщательно размешивают с 20-кратным количеством насыщенного раствора хлорида натрия, добавляя его при помешивании небольшими порциями. Всплывшие на поверхность крупные частицы удаляют кусочком бумаги или картона, баночку до краев наполняют раствором хлорида натрия и покрывают предметным стеклом так, чтобы нижняя поверхность соприкасалась с жидкостью. Баночку оставляют стоять на 45–90 мин (в течение этого срока яйца всплывают и держатся на поверхности смеси), затем предметное стекло осторожно поднимают, быстро переворачивают и приставшую пленку микроскопируют под малым увеличением без покровного стекла.
Методом Фюллеборна хорошо выявляются яйца цепня карликового и всех нематод, за исключением неоплодотворенных яиц аскарид. Так как яйца трематод, большинства цестод всплывают, нужно исследовать и осадок со дна баночки. Препараты из осадка малопрозрачны, поэтому для просветления можно добавить каплю глицерина.
Метод Красильникова (с применением детергентов). Под действием поверхностно-активных веществ, входящих в состав детергентов (стиральных порошков), яйца гельминтов освобождаются от фекальных масс и концентрируются в осадке.
Для этого используют 1%-ный раствор стирального порошка «Лотос» (порошок высушивают в сушильном шкафу при 100 °С в течение 1–2 ч; 10 г сухого порошка растворяют в 1 л водопроводной воды).
В центрифужную пробирку помещают комочек кала и приливают раствор детергента. Соотношение кала к жидкости 1 : 10. Хорошо перемешивают их до образования суспензии. Через 30 мин содержимое пробирки встряхивают 1–2 мин и центрифугируют 5 мин при 1500 об./мин. Из осадка готовят 2 препарата на одном стекле.
В практике работы лаборатории пользуются и другим способом. В этом случае жидкость не подвергается центрифугированию, а отстаивается в течение 24 ч для образования осадка, из которого также готовят мазки для микроскопирования.
Метод закручивания (по Шульману) очень прост, более эффективен, чем метод нативного мазка, однако ограничиваться им при исследовании на гельминты нельзя. Он служит дополнением к методам концентрации яиц и личинок.
В небольшой баночке высотой 6–7 см тщательно размешивают 2–3 г испражнений с 3–5-кратным количеством воды или изотонического раствора хлорида натрия. После этого стеклянной палочкой делают быстрые круговые движения (закручивание) в течение 1–2 мин. При круговом движении яйца и личинки собираются у конца стеклянной палочки. По окончании закручивания палочку с каплей взвеси быстро вынимают, каплю помещают на предметное стекло, а затем микроскопируют.
Метод Бермана применяется для выявления личинок гельминтов (угрицы). Полученный от больного кал (лучше свежевыделенный) в количестве 5 г помещают на мелкую металлическую сетку (удобна цедилка для молока) в стеклянную воронку, закрепленную в штативе. На нижний конец воронки надевают резиновую трубку с зажимом (аппарат Бермана). Сетку (цедилку) приподнимают и в воронку наливают нагретую до 50 °С воду таким образом, чтобы нижняя часть сетки была погружена в воду. Личинки из кала в связи с термотропностью активно выползают в теплую воду и скапливаются в нижней части воронки. Через 2–4 ч зажим открывают, жидкость выпускают в одну или две центрифужные пробирки. Цетрифугируют в течение 2–3 мин, после чего быстро сливают поверхностный слой, а осадок помещают на предметное стекло и исследуют под микроскопом.
Методы исследования других материалов на гельминты
Для диагностики энтеробиоза применяются специальные методы взятия материала: соскоб шпателем и снятие яиц липкой полиэтиленовой лентой. Применение этих методов основано на биологической особенности самок остриц откладывать яйца на перианальные складки кожи при выползании ночью из кишечника. В кале яйца, как правило, не обнаруживаются. Материал для исследования получают утром до дефекации или вечером, после 1,5 ч пребывания в постели.
Метод снятия яиц липкой лентой. Для этого берут кусок липкой ленты шириной около 2 см и длиной около 10 см. Прикладывают липким слоем середину ленты к перианальным складкам кожи, затем приклеивают ее на предметное стекло. В лаборатории ленту отклеивают, вносят под нее на большом протяжении 1–2 капли вазелинового масла и просматривают под микроскопом.
Метод соскоба шпателем. Широко применяется метод перианального соскоба деревянным шпателем. Шпатель (или плоско заточенную спичку) смачивают 50%-ным раствором глицерина.
Осторожно производят соскабливание с поверхности складок в окружности ануса и нижнего отдела прямой кишки. Затем материал тщательно соскабливают со спички краем покровного стекла, помещают его на предметное стекло в каплю 50%-ного раствора глицерина. Накрывают тем же покровным стеклом и микроскопируют. Шпатель после однократного пользования сжигают. Соскоб с перианальных складок производят троекратно.
Количественные методы исследования
Количественные методы используют для суждения об интенсивности инвазии путем определения числа яиц в 1 мл фекалий; применяют при оценке эффективности противоглистных препаратов и других методов лечения, а также результатов массовых противоглистных мероприятий. Число яиц подсчитывают до и после проведения соответствующих мероприятий.
Количественные методы применяются при тех гельминтозах, возбудители которых откладывают яйца в кишечнике более или менее равномерно (аскаридозе, трихоцефалезе, анкилостомидозе, трематодозе).
При цестодозах эти методы не используются, так как яйца не откладываются, а выделяются лишь при распаде или разрыве зрелых члеников. Количественные методы не применяются при энтеробиозе, так как острицы откладывают яйца в перианальной области.
Наиболее распространенным из количественных методов является метод Стола. В мерный цилиндр или специальную колбочку наливают децинормальный раствор едкого натра до метки 56 мл, затем прибавляют испражнения до тех пор, пока уровень жидкости не достигнет отметки 60 мл (приблизительно 4 г фекалий). Смесь тщательно взбалтывают со стеклянными бусами, закрыв сосуд пробкой. Тотчас после взбалтывания набирают градуированной пипеткой 0,075 мл смеси, которая содержит 0,005 мл кала. Содержимое пипетки переносят на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом (сосчитывают яйца во всем препарате).
Чтобы подсчитать количество яиц в 1 мл (1 г) фекалий, нужно число яиц умножить на 200. Например, если в 0,075 мл смеси, т. е. в 0,005 мл испражнений, обнаружено 5 яиц, то в 1 мл фекалий будет 1000 яиц.
Консервирование
Консервирование кала при исследовании на яйца гельминтов проводят с применением жидкости Шеляпиной (водный раствор формалина и глицерина), жидкости Красильникова (1%-ный раствор стирального порошка «Лотос»), 3%-ного раствора хлористоводородистой кислоты.
Анализаторы кала
Анализаторы скрытой крови в кале иммунохимические. Полуавтоматические, автоматические. Применяются для качественного или количественного определения скрытой крови в кале. Принцип работы основан на применении иммунологического метода определения или измерения гемоглобина в клиническом образце кала.