Таблица 44
Видовой состав нормальной микрофлоры влагалища
В зависимости от характера влагалищного секрета различают 4 степени чистоты влагалища.
I степень характеризует здоровое состояние половых органов. В секрете – влагалищные палочки и единичные клетки плоского эпителия; реакция секрета кислая (рН – 4–4,5).
II степень отмечается при отсутствии каких-либо общих и местных заболеваний; секрет содержит влагалищную палочку, но имеются и другие микробы (молочнокислая, кишечная палочки), единичные лейкоциты, много эпителиальных клеток; реакция – кислая (рН – 5–5,5).
III степень отмечается при патологическом состоянии полового аппарата; влагалищных палочек мало, много лейкоцитов и разнообразной флоры (стрептококки, стафилококки, грибы и др.), реакция слабокислая или основная (рН – 6–7,2).
IV степень наблюдается при заболеваниях самой влагалищной стенки; в секрете влагалищных палочек нет, очень много патогенных микробов, встречаются трихомонады, много лейкоцитов, эпителиальных клеток мало, реакция основная (рН выше 7,2).
Патологические выделения из половых органов женщин называются белями. Причинами их появления могут быть инфекции, паразитарные и глистные инвазии, микозы, новообразования, механические и термические воздействия и др.
Воспаление влагалища (вагинит, кольпит) может возникнуть в результате трихомонадной инвазии, септической инфекции, заражения гонореей, кандидомикозом (грибковый кольпит) и по другим причинам. Характер выделений – гнойные, слизистые, белые бели, их микроскопическое и бактериологическое исследования помогают установить причину заболевания и назначить соответствующее лечение. С этой же целью исследуется соскоб с поверхности влагалища или шейки матки.
Возможной находкой при исследовании выделений из влагалища может быть примесь крови или скопление больших атипичных клеток, встречающихся при распаде злокачественной опухоли влагалища.
К числу инфекционных заболеваний женских половых органов относятся туберкулезное поражение матки, маточных труб, яичников, влагалища.
Диагностика туберкулеза гениталий достаточно сложна в связи с тем, что это заболевание редко проявляется в форме острого воспаления. Лабораторная диагностика туберкулеза гениталий базируется на исследовании белей, гистологических препаратов (мазков, соскобов); выявлении туберкулезной палочки, бактериологических исследованиях.
При исследовании клеточного состава влагалищных мазков можно определить и характер созревания клеток под влиянием циклически меняющейся секреции половых гормонов. При низкой эстрогенной стимуляции в мазках выявляются парабазальные клетки, по мере возрастания эстрогенной стимуляции в мазке увеличивается содержание промежуточных клеток, а при высокой стимуляции – и поверхностных. Количественная оценка этих изменений производится с помощью индекса созревания, кариопикнотического и эозинофильного индексов.
В норме кариопикнотический индекс равен: в фолликулярную фазу – 1–30%, в середине цикла —50–80%, в лютеиновую фазу – более 80%; эозинофильный индекс равен в фолликулярную фазу – 1–30%, в середине цикла – 20–70%, в лютеиновую фазу – более 70%.
Необходимо подчеркнуть, что воспалительные заболевания половых органов – одна из частых причин женского бесплодия.
Исследование с целью определения функционального состояния яичников
Взятие материала производят из заднебокового свода влагалища. Материалом из заднего свода влагалища пользоваться не следует, так как в нем скапливаются ранее отторгнутые эпителиальные клетки. Содержимое насасывают стеклянной пипеткой с резиновым баллончиком. При необходимости получения большего количества материала содержимое можно брать гинекологической ложечкой. Материал, взятый ватным тампоном, для исследования не годится.
Содержимое равномерно распределяют на предметном стекле. Мазки высушивают на воздухе и окрашивают.
Необходимый реактив
1%-ный водный раствор метиленового синего.
Ход окраски
На высушенный препарат наносят 1–2 капли метиленового синего, покрывают покровным стеклом. Окрашивают в течение 1–2 мин. Затем мазок промывают дистиллированной водой следующим образом: у одного края покровного стекла наносят 1–2 капли дистиллированной воды, к противоположному краю прикладывают полоску фильтровальной бумаги. Таким образом препарат промывают несколько раз до получения бледно-синей окраски, затем высушивают.
Необходимый реактив
3 г кислого фуксина растворяют в 100 мл 95%-ного спирта. К 12 мл этого раствора прибавляют 100 мл дистиллированной воды.
Ход окраски
На высушенный препарат наливают фуксин на 1 мин, затем смывают водой, высушивают. Таким же способом можно окрашивать мазки и метиленовым синим.
Необходимые реактивы
1. Смесь Никифорова.
2. Водный раствор гематоксилина (гематоксилин – 1 г, калийные квасцы – 50 г, йодистый натрий или калий – 0,2 г, дистиллированная вода – 1000 мл; раствор выдерживают на свету в течение 14 дней, после чего он готов к употреблению).
3. 1%-ный водный раствор эозина.
Ход окраски
Высушенные мазки фиксируют в смеси Никифорова (10–15 мин). Окрашивают водным раствором гематоксилина в течение 7–10 мин до слабо-фиолетового цвета.
Промывают проточной водой. Окрашивают 1%-ным водным раствором эозина в течение 30 с. Промывают проточной водой и высушивают.
Необходимый реактив
В продаже имеется готовый раствор краски Романовского следующего состава: азур II – 3 г; эозин водорастворимый желтый – 0,8 г; метиловый спирт – 250 мл; глицерин – 250 мл.
В продаже имеется также сухая краска Романовского, из которой готовят раствор краски следующим образом: 3,8 г сухой краски Романовского растворяют в 250 мл чистого метилового или этилового спирта (последний хуже). Раствор оставляют на 3–5 суток, часто взбалтывая для лучшего растворения краски. Затем прибавляют 250 мл чистого глицерина и вновь оставляют на 3–5 суток, периодически взбалтывая. Приготовленная таким образом краска хорошо сохраняется длительное время в темных бутылях в шкафу, где нет ни кислот, ни щелочей, без взбалтывания.
Вновь полученный или приготовленный раствор краски Романовского перед употреблением оттитровывают, т. е. окрашивают несколько фиксированных мазков в течение 25–40 мин различно разведенной краской (1–2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды). По хорошо окрашенному препарату устанавливают нужное количество капель краски на 1 мл и время окрашивания.
Ход окраски
Фиксированные мазки укладывают на мостик для окраски, представляющий собой стеклянные палочки, уложенные на 2 противоположных края кювета. Затем мазки заливают краской в разведении 1–2 капли на 1 мл дистиллированной воды. Краску наливают на мазок как можно более высоким слоем, и окрашивание длится в зависимости от температуры воздуха в помещении от 25 до 45 мин. Если температура в помещении низкая или требуется быстрее окрасить мазки, то разведенную краску можно подогревать до 60–70 °С (до кипения доводить нельзя).
После окончания окраски краску смывают (но не сливают) сильной струей воды и ставят мазки вертикально в деревянный штатив для просушивания. Разведенной краской можно пользоваться только в течение одного дня.
Необходимые реактивы
1. Смесь Никифорова.
2. Спирты 95, 90, 80, 70 и 50°.
3. Гематоксилин Гарриса.
4. 0,25%-ный раствор соляной кислоты.
5. Краска оранжевая Г.
6. Краска (ЕА-36).
7. Абсолютный спирт.
8. Ксилол.
9. Канадский бальзам.
Приготовление гематоксилина Гарриса
1 г гематоксилина растворяют в 10 мл абсолютного спирта, 20 г калийных квасцов растворяют при нагревании в 200 мл дистиллированной воды. Через 24 ч оба раствора соединяют и прибавляют 0,5 г красной или желтой окиси ртути. Раствор нагревают до кипения, остужают и через 24 ч фильтруют.
Приготовление раствора краски оранжевая Г
К 100 мл 0,5%-ного спиртового раствора оранжевой краски Г добавляют 0,015 г фосфорно-вольфрамовой кислоты.
Приготовление составной краски (ЕА-36)
45 мл 0,5%-ного спиртового раствора светлой зеленой, 10 мл 0,5%-ного спиртового раствора бисмаркбраун, 45 мл 0,5%-ного спиртового раствора эозина желтоватого (водо– и спирторастворимого), 0,2 г фосфорно-вольфрамовой кислоты, капля насыщенного водного раствора углекислого лития.
Ход окраски
Мазки после фиксации проводят последовательно через сосуды, содержащие 80%-, 70%– и 50%-ные спирты и дистиллированную воду. Затем 6 мин гематоксилином Гарриса осторожно споласкивают дистиллированной водой и погружают (6 раз) в 0,25%-ный раствор соляной кислоты.
Далее на 6 минут кладут в сосуд с проточной водопроводной водой и обмывают дистиллированной водой. Затем проводят через 50, 70, 80 и 95%-ные спирты. Обезвоженные таким образом препараты окрашивают в течение 1,5 мин краской оранжевой Г, споласкивают в двух сменах 95%-ного спирта и красят в течение 1,5 мин составной краской (ЕА-36). Мазки отмывают от избытка краски в трех сменах 95%-ного спирта. Далее препараты просветляют проведением через абсолютный спирт, через смесь абсолютного спирта и ксилола в равных объемах и наконец через ксилол, после чего заключают в канадский бальзам.
Из приведенных выше окрасок самые простые – окраска фуксином и метиленовым синим, но эти окраски не дают полного представления обо всей цитологической картине. Метод Папаниколау сложен, требует много дефицитных и дорогостоящих реактивов, поэтому реже используется в практической работе лабораторий. Окраска по Романовскому вполне пригодна для цитологического исследования влагалищных мазков и выгодно отличается тем, что может применяться в любой лаборатории.
Клеточный состав влагалищного мазка
В мазках из влагалища различают 4 вида клеток плоского эпителия.
1. Клетки поверхностные большие (35–55 мк), полигональной формы, ядро маленькое (6 мк), пикнотичное. Клетки чаще располагаются раздельно. Цитоплазма клеток очень слабо окрашивается, ядро темное. В большом количестве встречаются главным образом с 9 по 14-й день менструального цикла.
2. Промежуточные клетки большие (25–30 мк), форма неправильная, ядро более крупное, круглое или овальное. Клетки часто располагаются пластами. Цитоплазма окрашивается интенсивнее, чем у поверхностных клеток, ядро более светлое. Встречаются во всех фазах менструально-овариального цикла.
3. Парабазальные клетки – меньших размеров, круглой или овальной формы, с большим круглым ядром. Диаметр ядра немного меньше, чем ширина ободка цитоплазмы. Окрашиваются чаще в базофильные тона. Иногда морфологические черты парабазальных клеток неясно отличимы от клеток базальных.
4. Клетки базальные (или атрофические) – округлой формы, несколько меньших размеров, чем парабазальные, ядро круглое, большое, занимает большую часть клетки. Цитоплазма окрашивается в интенсивные базофильные тона (некоторые авторы называют клетки с такой морфологией парабазально-базальными). Клетки встречаются во время менопаузы и единичные во время менструаций и после родов.
Слизистая оболочка влагалища в норме выстлана многослойным плоским эпителием. В зависимости от соотношения клеток разных слоев эпителия в мазках различают 4 типа клеточных реакций, которые позволяют судить о функциональном состоянии яичников.
1. Много базальных клеток и большое количество лейкоцитов. Этот тип мазка указывает на резкую недостаточность гормонов яичников (эстрогенов).
2. В мазке значительное количество базальных клеток, довольно много промежуточных, значительное количество лейкоцитов. Соответствует умеренно выраженной недостаточности гормонов.
3. В мазке преобладают промежуточные клетки, иногда нечетко контурированные, могут лежать пластами. Базальных клеток немного. Такая картина мазка указывает на легкую степень недостаточности эстрогенов.
4. Мазок состоит из поверхностных клеток. Такой тип мазка соответствует достаточной секреции эстрогенов.
Исследование влагалищного мазка нельзя производить при наличии воспалительных процессов (выделений), после влагалищных манипуляций, при внутривлагалищном применении медикаментов. После полового сношения мазки берут не раньше чем через 24 ч.
Тест влагалищного мазка применяется для установления показаний и контроля над результатами гормонотерапии. У женщин с нормальным овариально-менструальным циклом картина влагалищных мазков в зависимости от фазы цикла может быть третьей или четвертой (фаза пролиферации – третий тип реакции, в период овуляции и в ближайшие дни после нее – третий или четвертый).
Для решения вопроса о функциональном состоянии яичников применяют ряд цитохимических (определение гликогена и ферментов в клетках) и биохимических методов (определение ферментов во влагалищном содержимом, кислотности, молочной кислоты и др.).
Для исследования влагалищных мазков также используется люминесцентная и фазовоконтрастная микроскопия, данные которой дополняют трактовку функционального состояния яичников. Для более правильной оценки влагалищного мазка, кроме вида клеток и их количества, учитывают так называемые индексы; наибольшее значение они имеют для суждения о нарушении функции яичников. К таким индексам относятся:
1) кариопикнотический индекс – отношение числа поверхностных клеток с пикнотическими ядрами к общему числу клеток мазка;
2) атрофический индекс (индекс глубоких клеток) – отношение числа базальных и парабазальных клеток к общему числу клеток мазка;
3) индекс промежуточных клеток – отношение числа промежуточных клеток к общему числу клеток мазка;
4) эозинофильный индекс – отношение числа ацидофильных поверхностных клеток к общему числу базофильных поверхностных клеток.
При изучении цитологической картины влагалищного мазка можно использовать упрощенную схему Видаля (табл. 45).
Таблица 45
Оценка кольпоцитограммы
В настоящее время цитологический метод оценки функции яичников заменяется определением концентрации половых гормонов в крови.
Наибольшее значение имеет кариопикнотический индекс, показатели которого наиболее точно совпадают с уровнем выделения с мочой половых гормонов (табл. 46).
Таблица 46
Показатели кариопикнотического индекса в течение овуляторного менструального цикла
Исследование на клетки новообразований
Материал, взятый из влагалища путем отсоса пипеткой с пораженного участка (эрозии, язвы), тампоном или путем отпечатка, может служить для обнаружения клеток злокачественных опухолей. Из полученного отделяемого приготавливают тонкие препараты и красят по Романовскому или другими методами, принятыми в цитологии. Если количество полученного материала достаточное, просматривают предварительно нативные препараты.
Исследование влагалищного содержимого на степень чистоты
Мазки для исследования на влагалищную палочку (палочку Деферлейна) готовят так же, как для цитологического исследования. Окрашивают по Граму.
Необходимые реактивы
1. Карболовый раствор генцианвиолета (1 г генцианвиолета растворяют в 10 мл 96%-ного спирта, раствор выливают в 100 мл 1–2%-ной карболовой кислоты, взбалтывают).
2. Раствор Люголя (1 г йода, 2 г йодистого калия и 300 мл дистиллированной воды; йод и йодистый калий растворяют сначала в 5–8 мл воды, а затем приливают остальную воду).
3. 96%-ный спирт или сырец.
4. 40%-ный раствор карболового фуксина (10 мл карболового фуксина и 90 мл дистиллированной воды).
Ход окраски
На фиксированный препарат кладут полоску фильтровальной бумаги и наливают раствор генцианвиолета. Окрашивают в течение 1,5–2 мин. Бумажку сбрасывают и заливают препарат раствором Люголя на 2 мин. Раствор Люголя сливают и прополаскивают препарат в спирте до сероватого цвета. Промывают водой и окрашивают 10%-ным раствором карболового фуксина в течение 10–15 с. Снова промывают водой, высушивают препарат на воздухе.
По своей морфологии палочка Деферлейна грубая, толстая, грамположительная. Различают 4 степени чистоты влагалища (см. выше).
Основным условием для существования влагалищной палочки является высокая степень кислотности (рН 4,0–4,7). Во влагалищном содержимом и в эпителии содержится в большом количестве гликоген.
Существует тесная связь между рН влагалища и количеством гликогена. Кокковая флора соответствует низкому содержанию гликогена и низкой степени кислотности влагалищного содержимого. Степень чистоты может служить относительным тестом функционального состояния влагалища, особенно при аномалиях менструального цикла.
Приготовление нативного препарата
Каплю отделяемого из влагалища, взятого пипеткой или петлей, наносят на предметное стекло, покрывают покровным и тотчас микроскопируют. В нативном препарате обнаруживают подвижные формы, которые распознаются по характерному движению ундулирующей мембраны. После потери движения микроорганизм в нативном препарате распознать нельзя.
Каплю отделяемого распределяют на стекле тонким слоем. Мазки высушивают. Для окрашивания предложено много различных методов: метиленовый синий, окраска по Граму, метод Романовского и др.
Из перечисленных методов наиболее удобным является метод Романовского. При этой окраске трихомонады распознаются легко (ядро фиолетовое, протоплазма вакуолизированная голубая, содержащая бактерии). При этом хорошо виден окружающий их клеточный фон (нейтрофилы, эозинофилы и эпителиальные клетки). В мазках, окрашенных метиленовым синим, трихомонады легко спутать с измененными клетками.
Отделяемое влагалища исследуют в основном для обнаружения гонококков. В некоторых случаях можно обнаружить и другие патогенные микроорганизмы:
1) палочка дифтерии при дифтерии половых органов. Истинную природу обнаруженной палочки устанавливают только путем бактериологического исследования и проверкой на вирулентность. Дифтерия половых органов – очень редкое заболевание;
2) Bacillus crassus – возбудитель острой язвы вульвы Чапина—Люпшютца. В этом случае при бактериологическом исследовании мазков гнойного отделяемого, окрашенных по Граму, обнаруживают грамположительные палочки длиной от 7–8 до 40 мк, с обрезанными концами, располагающиеся иногда короткими цепочками, а иногда лежащие внутриклеточно. Поражение вульвы и влагалища может быть также грибковой природы (например, грибок молочницы).
Изливающиеся воды при разрыве плодного пузыря принимают иногда за подтекающую мочу. Правильность трактовки в таких случаях устанавливается микроскопическим исследованием.
Необходимые реактивы
1. Раствор Судана 3.
2. 1%-ный водный раствор эозина.
Ход исследования
Собранную жидкость помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают, из осадка готовят препараты и микроскопируют.
Элементы околоплодных вод: «чешуйки» плода, пушковые волосы (lanugo), капли жира.
Каплю осадка наносят на стекло и покрывают покровным стеклом. Тонким концом пипетки с баллоном впускают под покровное стекло каплю 1%-ного водного раствора эозина, который равномерно прокрашивает препарат. Избыток краски отсасывают фильтровальной бумагой с противоположного края покровного стекла. Затем точно таким же путем препарат промывают водой. При микроскопии на розовом фоне обнаруживают неокрашенные, хорошо контурированные безъядерные клетки кожи плода («чешуйки»), которые часто лежат скоплениями. «Чешуйки» не воспринимают окраску эозином, так как они покрыты первородной смазкой (жиром). Клетки влагалищного эпителия красятся в ярко-розовый цвет; ядра хорошо выражены.
К капле осадка прибавляют каплю раствора Судана 3, покрывают покровным стеклом. При микроскопии видны капли жира, окрашенные в оранжевый цвет. При определении жира в околоплодных водах требуется тщательно обработанная посуда (обезжиренная).
Обнаружение пушковых волос (lanugo) производят в нативном препарате. Определение «чешуек» дает 99% положительных находок при исследовании раннего отхождения околоплодных вод, обнаружение капель жира – в 100%, lanugo выявляются редко.
Взятие материала
У женщин отделяемое берут одновременно из уретры, влагалища и шейки матки. Выделения из бартолиниевых желез исследуют только по клиническим показаниям. Иногда берут выделения из прямой кишки: спустя 3–4 ч после опорожнения кишечника делают смыв физиологическим раствором, который центрифугируют, после чего исследуют осадок.
У мужчин берут отделяемое из уретры (утром до первого мочеиспускания), секрет простаты, полученный после массажа железы, или мочу, выделенную после массажа. Кроме того, исследуют мочу, собранную утром после длительного воздержания от мочеиспускания. У девочек отделяемое берут из уретры, влагалища и прямой кишки (промывные воды).
Из полученного материала готовят тонкие мазки. Если материалом для исследования служит моча, то препараты готовят из осадка после центрифугирования.
Высушенные и фиксированные над пламенем препараты (делают, как правило, не меньше двух препаратов) окрашивают по Граму и метиленовым синим.
Окраска метиленовым синим
Фиксированные препараты заливают 0,5–1%-ным водным раствором метиленового синего на 1 мин; промывают водой и высушивают.
Окраска по Граму
Окраска по Граму требует особой тщательности, так как при недостаточном обесцвечивании гонококки могут сохранить окраску Грама, при слишком длительном обесцвечивании окраску могут терять другие грамположительные кокки (стафилококки, стрептококки). Это может привести к ошибочным результатам. Для цитологического исследования препараты окрашивают по Романовскому (при этом нередко обнаруживают эозинофилы, особенно в период выздоровления).
При исследовании под микроскопом гонококки имеют форму кокков, парно расположенных. Поверхности, обращенные друг к другу, несколько уплощены. Гонококки часто располагаются кучками, в острых случаях заболевания находятся главным образом в лейкоцитах. При окраске по Граму обесцвечиваются и окрашиваются в розовый цвет (грамотрицательно).
Бактериоскопический метод, хотя и является основным для выявления гонококков, имеет ряд недостатков: сравнительно редкое обнаружение гонококков и трудность их дифференцирования от другой кокковой флоры, особенно в случаях, когда проводилось лечение. Однократный отрицательный результат не доказателен, поэтому требуются повторные исследования.
При исследовании мазков от больных гонореей в основном наблюдается бактериоскопическая картина 3 видов.
1. Лейкоциты покрывают все поле зрения; часто гонококки расположены внутриклеточно. Имеются также гонококки, лежащие свободно. Другие микроорганизмы при этом не обнаруживаются.
2. Клеточная картина та же самая, но гонококков нет. Посторонняя флора отсутствует. Такая картина часто наблюдается при хронической гонорее.
3. Небольшое количество дегенерированных лейкоцитов и обильная посторонняя флора, появление которой говорит об улучшении течения процесса.