Метод основан на сравнении уровня гемоглобина в периферической крови и спинномозговой жидкости. М. М. Гунеф использовал для определения гемоглобина в ликворе 0,04%-ный раствор аммиака.
Ход определения
5 мл геморрагической спинномозговой жидкости центрифугируют в течение 10 мин, осадок растворяют в 5 мл 0,4%-ного раствора аммиака, можно брать и меньше, важно, чтобы количество жидкости и раствора аммиака было одинаковым. Кровь из пальца в количестве 20 мл смешивают с 5 мл 0,4%-ного раствора аммиака.
Концентрацию гемоглобина определяют на аппарате при длине волны 542.
Биохимические методы исследования
Определение глюкозы
Определение глюкозы в спинномозговой жидкости осуществляется с помощью цветной реакции или на биохимическом анализаторе так же, как и в крови. В норме в ликворе содержится глюкоза в пределах 2,8–3,9 ммоль/л. При остром и подостром серозном менингите содержание глюкозы увеличивается. Увеличение ее содержания в ликворе при нормальном содержании в крови наблюдается при явлениях раздражения оболочек мозга.
Определение содержания глюкозы в спинномозговой жидкости должно проводиться с исследованием сахара крови.
Глюкозооксидаза окисляет глюкозу с образованием перекиси водорода, которая под действием пероксидазы окисляет ортотолуидин с образованием синего хромогена. Обе реакции протекают одновременно при рН 4,8.
Необходимые реактивы
1. Натрия хлорид – 9 г/л (изотонический раствор). Готовят, растворяя 0,9 г NaCl в 100 мл жидкости.
2. Цинка сульфат – 50 г/л, 5 г сульфата цинка (ZnSO4) растворяют в воде, объем доводят до 100 мл.
3. Натр едкий – 0,3 ммоль/л готовят, растворяя в воде, доводят до 100 мл.
4. Натр едкий – 0,3 ммоль/л готовят, растворяя 1,2 г NaOH в 100 мл воды, концентрацию проверяют титрованием.
5. Ортотолуидина 1%-ный раствор: 1 г препарата растворяют в 100 мл 96%-ного спирта. Раствор можно хранить в холодильнике в склянке с притертой пробкой в течение нескольких месяцев.
6. Ацетатный буферный раствор pH 4,8: смешивают 4 части 0,25 г уксусной кислоты и 6 частей 0,25%-ного ацетата натрия.
7. Глюкозооксидаза. Сухой препарат активностью 3000 ЕД/мг или больше.
8. Пероксидаза из крови – 1 мл растворяют в 5 мл ацетатного буфера.
9. Рабочий реактив: в 80 мм ацетатного буфера растворяют 2 мг глюкозооксидазы и 1 мг пероксидазы, прибавляют 1 мл 1%-ного раствора ортотолуидина и доводят объем буферным раствором до 100 мл. Рабочий реактив должен быть прозрачным, бесцветным или иметь слабо-зеленый оттенок, в этом случае он устойчив при хранении на холоде. Если же окраска интенсивная или спустя несколько часов после хранения начинает выпадать осадок, это значит, что ортотолуидин недостаточно чистый и его надо перекристаллизовать.
10. Калибровочные растворы глюкозы. Глюкозу предварительно высушивают при 37 °С и хранят в эксикаторе. Сначала готовят основной раствор с концентрацией 50 ммоль/л, для чего 180 мл вещества растворяют в 20 мл насыщенного раствора 0,3%-ной бензойной кислоты. Из этого раствора готовят рабочие калибровочные растворы, содержащие 3; 6; 9; 12; 15; 18 и 21 ммоль/л. Для этого берут 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3; 3,6 и 4,2 мл основного раствора и доводят насыщение раствором до 10 мл.
Ход определения
В центрифужные пробирки вносят 1,1 мл сульфата цинка и 0,4 мл 0,3%-ного раствора NaOH, перемешивают. При этом образуется тонкий гель гидрата окиси цинка, в него впускают 0,1 мл спинномозговой жидкости, снова перемешивают и в течение 10 мин центрифугируют. К 1 мл надосадочной жидкости добавляют 3 мл рабочего реактива и осторожно перемешивают. Постепенно развивается окрашивание, которое возникает максимум через 13–15 мин, а затем постепенно уменьшается. Фотометрируют через один и тот же промежуток времени после добавления рабочего реактива в кюветах с длиной оптического пути 1 см, длина волны 625 нм холостого опыта. При приготовлении калибровочного графика вместо проб крови берут 0,1 мл соответствующего калибровочного раствора. Расчет можно проводить по калибровочному графику, для построения которого на одной оси откладывают концентрацию глюкозы (моль/л), а на другой – величины экстинкции.
Определение хлоридов
Определение хлоридов может осуществляться методом титрования или на электролитном анализаторе.
Пониженное содержание хлоридов в ликворе характерно для менингита, особенно туберкулезного, при бруцеллезе, повышенное – при опухолях мозга, абсцессах мозга, эхинококкозе.
Определение мочевины, билирубина, холестерина
Имеет небольшое диагностическое значение.
Определение гликопротеинов и липопротеинов спинномозговой жидкости производят с помощью электрофореза на бумаге с предварительным сгущением жидкости.
Диагностика заболеваний
Для диагностики туберкулеза используются триптофановая реакция с 2%-ным формалином, 0,06%-ным раствором цитрата натрия и концентрированная соляная кислота.
Необходимые реактивы
1. 2%-ный водный раствор формалина (1 часть формалина и 19 частей дистиллированной воды).
2. 20,6%-ный раствор азотистого натрия (NaNO2), готовится ex tempera из 0,6%-ного раствора (1 часть его и 9 частей дистиллированной воды).
3. Концентрированная соляная кислота.
Ход определения
В широкую пробирку отмеривают 3 мл спинномозговой жидкости, прибавляют 15 мл концентрированной соляной кислоты и 2–3 капли раствора формалина, слегка встряхивают и дают постоять в течение 5 мин, а затем доливают 2 мл раствора азотистокислого натрия. При положительной реакции на границе жидкостей образуется нежное фиолетовое кольцо, которое при стоянии исчезает. При отрицательной реакции кольцо совсем не образуется или имеет коричневый цвет.
При туберкулезном менингите в отличие от менингита другой этиологии реакция часто бывает положительной.
Метод основан на окислительно-восстановительной реакции раствора перманганата калия и осаждении белка трихлоруксусной кислотой.
Необходимые реактивы
1. 1%-ный водный раствор перманганата калия, приготовленный на бидистиллированной воде и постоявший не менее 2–3 недель.
2. 20%-ный раствор трихлоруксусной кислоты.
Ход исследования
К 1 мл ликвора прибавляют 0,05 мл (1 каплю) реактива 1, смесь хорошо взбалтывают. В нормальной спинномозговой жидкости наблюдается яркое фиолетовое окрашивание, которое долго сохраняется. Цвет не меняется от прибавления 2–3 капель реактива 2.
Реакция используется для ранней диагностики менингита. В ранней стадии менингита при смешивании ликвора с раствором перманганата калия фиолетовая окраска переходит в красно-желтый и коричнево-желтый цвета.
При добавлении трихлоруксусной кислоты (реактив 1) в случаях гнойного менингита цвет доходит до светло-желтого или наступает полное обесцвечивание с одновременным помутнением и осаждением белка.
Изменение цвета по типу менингеальной реакции не наступает при других органических поражениях мозга: травме, опухоли, сифилисе мозга, рассеянном склерозе и других, протекающих без менингеальных симптомов.
Микробиологическое исследование
Микробиологическое исследование цереброспинальной жидкости проводится в случаях, сходных с менингитом, а также при коматозных состояниях и неврологических симптомах неясного генеза.
Спинномозговая жидкость стерильна, поэтому положительный результат исследования – это всегда расшифровка диагноза.
Этиология менингитов очень разнообразна.
Наиболее часто выделяют следующие микроорганизмы:
1) при гнойных менингитах: менингококк, пневмококк, стафилококк золотистый, стрептококки групп А, В, D, Н, бактерии коли, протеус, псевдомонос и др.;
2) при асептических менингитах: туберкулезная палочка, возбудитель лептоспироза, токсоплазмоза, вирусы.
Пробы должны проводиться асептично.
Забор материала собирают в 2 стерильные пробирки.
Одна направляется на цитологическое исследование, вторая – на бактериологическое исследование в объеме до 10 мл, у взрослых – 15 мл.
Учитывая, что часть возбудителей чувствительна к охлаждению, материал должен быть доставлен в лабораторию как можно скорее, и при доставке должна поддерживаться температура 37 °С.
Доставленную пробу центрифугируют. Надосадочную жидкость стерильной пипеткой помещают в пробирку и используют для биохимического и серологического исследований.
Оставшийся осадок и около 0,5 мл жидкости используют для изготовления мазков для посева.
Из осадка делают 2 тонких мазка на стекле, окрашивают по Граму метиленовым синим и немедленно микроскопируют.
Иногда на типичной морфологии могут быть выявлены только возбудители – как менингококк, пневмококк.
Результаты первичной микроскопии служат основанием предварительной диагностики. Для посева берут 10 мл жидкости в стеклянной пробирке.
Посев спинномозговой жидкости производят на следующие питательные среды:
1) двойную среду;
2) среду для контроля стерильности;
3) жидкую среду Сабуро;
4) среду Рапопорт.
К осадку, оставшемуся в пробирке, добавляют 5 мл сывороточного полужидкого кляра – среду обогащения.
Проверку роста проводят после ночной инкубации, а в дальнейшем ежедневно в течение 7 дней до появления роста.
При отсутствии роста дается отрицательный результат на 9– 10-й день.
Выделение микроорганизмов из спинномозговой жидкости свидетельствует об их этиологической роли.
Должна быть проведена количественная оценка бактериального роста.
Таблица 48