Думаем дальше: а что можно сделать, если не избавляться от обычных нуклеотидов? Пусть полимераза их использует, разрешаем. Пусть она нарастит такие длинные цепочки, какие сможет. А потом слегка нагреем раствор, чтобы двойные цепочки ДНК расплавились и разошлись, и охладим, чтобы к однонитевой ДНК присоединились новые праймеры. Олигов, как мы помним, у нас много, добавим в смесь, сколько не жалко…
Но позвольте, ведь теперь, кроме ДНК образца, у нас появились еще две нити, синтезированные в первой реакции, и каждая из них тоже содержит участок, комплементарный противоположно направленному праймеру. Четыре цепочки ДНК вместо двух изначальных… Стоп! Но это же как раз то самое, что нам было нужно: увеличение концентрации интересующего нас участка ДНК, чтобы он стал заметнее на фоне всей остальной ДНК, которая нас сейчас не интересует.
А если сделать это специально?
А если сделать это не один раз, а два, три, четыре, пять, шесть? И в каждом цикле число нитей ДНК будет удваиваться, как в той сказке про царя, изобретателя шахмат и рисовые зерна на шахматной доске…
Кэри остановил машину, нашел в бардачке ручку и бумагу и начал считать. Если, скажем, раз 30 повторить этот цикл – “добавить к образцу полимеразу, нуклеотиды и праймеры – провести реакцию – расплавить ДНК – провести реакцию” – то образец будет содержать множество копий интересующего нас фрагмента ДНК, а все остальное, ненужное и путающее, станет на его фоне малозначащей примесью.
Дженнифер проснулась и спросила, почему они не едут. Кэри снова тронулся в путь и примерно через милю сообразил, что праймеры необязательно должны быть разделены всего одним нуклеотидом. Черт с ними, с точечными мутациями – таким способом можно получить в достаточном количестве любой фрагмент ДНК!
До изобретения Кэри Муллиса эти фрагменты получали в основном клонированием. Слово “клонирование” вообще означает получение множества копий одного объекта. Клонирование животных – получение генетически идентичных копий особи из ее соматических, то есть неполовых клеток. Клонирование человека – популярный фантастический сюжет, с приматами дело пока не очень ладится (лишь в начале 2018 г., через 22 года после овцы Долли, китайцы опубликовали статью о клонировании детенышей макаки). Клонирование растений широко известно под названием “черенкование”. Клонирование клеток, например лимфоцитов, вырабатывающих антитела, – размножение клеток определенного типа.
Клонированием ДНК называли довольно сложную процедуру – включение нужного фрагмента в кольцевую ДНК (плазмиду), внедрение этой ДНК в кишечную палочку E.coli и выращивание этих кишечных палочек, сначала на чашке Петри, потом в колбе с питательной средой. Бактерии размножаются, копируют плазмиду и вместе с ней наш кусок ДНК; потом плазмиду можно будет выделить, вырезать нужный кусок рестриктазой и отделить его от других с помощью электрофореза. Дело долгое, к тому же культура кишечной палочки пахнет замоченным и протухшим бельем (точнее, наоборот, таз с бельем у нерадивой хозяйки имеет запах этой бактерии). Но ДНК нужна для работы, да и запах привычного человека радует: если так пахнет, значит, культура не загрязнена посторонними микроорганизмами.
Что представляло собой клонирование ДНК на тот момент, когда Кэри Муллис вез Дженнифер в горы? Ну, например, как-то так. Интересующую нас ДНК нарезаем рестриктазой на куски по несколько тысяч пар нуклеотидов. Затем фрагменты вставляем в плазмиду, или вектор, – колечко ДНК, предварительно разрезанное той же рестриктазой. Плазмиды бактерий – дополнительные, внехромосомные генетические элементы, которыми они могут обмениваться или поглощать их из внешней среды. Плазмида может содержать некие дополнительные гены, полезные в определенных условиях, например гены устойчивости к антибиотику. Внедрение вектора в бактерии называется трансформацией – это, по сути, тот самый процесс, который использовали для доказательства роли ДНК как наследственного материала Эвери с коллегами в первой главе, помните?
Чтобы бактерия не перестала копировать наш вектор, в нем как раз и содержатся гены устойчивости к антибиотику, и тот же антибиотик добавлен в агар-агар в чашке Петри. Кто отказался от вектора, тот не выживет. Но как отличить бактерию с “пустым” вектором от бактерии с вектором, в который вставлен фрагмент ДНК? Для этого фрагмент вставляется не куда попало, а в другой ген, отвечающий за синтез красителя. Трансформированные бактерии высевают на агар-агар – не густо, с таким расчетом, чтобы из каждой бактерии выросла одна точечка-колония. По цвету колонии отличают встройки от пустышек.
Стерильной зубочисткой колонии бактерий, содержащие плазмиды с нашей ДНК, перемещают в колбу с жидкой средой, колбу в термостат и наращивают биомассу. Игла в яйце, яйцо в утке… А куда деваться?
Коллекция клонированных фрагментов из одного образца называется ДНК-библиотекой.
Так вот, с самого начала было очевидно, что ПЦР намного удобнее! Клонирование in vitro, не в живой клетке, а в пробирке! Любой фрагмент ДНК в любом количестве, без всех этих танцев с бубнами вокруг кишечной палочки. И, что еще более важно, – определенный фрагмент, тот самый, который находится между нашими праймерами. Кэри снова затормозил: о такой потрясающей возможности опасно было думать на ходу.
Какой бы жуткой смесью ни была наша исходная ДНК, благодаря магии комплементарности мы получим именно нужный участок. Интересующий нас ген у конкретного человека. Ген, который мы еще не изучали, но который изучен для другого вида (мы помним, что большинство гомологичных генов млекопитающих сходны между собой)… Да это же бомба! Не какое-то там предложение по оптимизации, а открытие, которое перевернет молекулярную биологию! “«Тор всемогущий!» – вскричал я”.
…Нет, не может быть. Используя только хорошо известные методы, делая то, что все уже давно делают, разве что чуть-чуть по-другому, решить сразу несколько самых докучных проблем молекулярной биологии – это слишком просто и слишком здорово, такого не бывает. Или кто-то уже придумал это и прямо сейчас делает и вот-вот опубликуется или уже опубликовался. Или Кэри упускает что-то очевидное, и все это невозможно по какой-то фундаментальной причине, как невозможны вечный двигатель и летающая свинья.
Сонная Дженнифер не захотела выслушать его очередную гениальную идею. Сам же Муллис этой ночью не спал и все выходные проработал. Чертил бесконечные схемы своей реакции, взбадривался местным каберне, считал себя то гением, то идиотом, неспособным увидеть ошибку, которая обязана быть во всем этом, просто обязана, потому что жизнь – это боль. Интернета тогда не было, и телефона в коттедже не было, и до начала рабочей недели он не мог ни поделиться ни с кем, кроме Дженнифер (которая так и не проявила энтузиазма), ни проверить свои соображения по литературным данным.
К Нобелевской премии и далее
В понедельник поход в библиотеку показал: никто еще не пытался амплифицировать ДНК с помощью двух праймеров, и нет никаких очевидных причин, запрещающих это делать! Аналогичный результат дали беседы с коллегами. (Как это обычно бывает, много позднее дотошные люди откопали публикацию норвежского биохимика Хьелля Клеппе, работавшего у нобелевского лауреата Хара Гобинда Кораны, и их соавторов. Там были несколько фраз, очень похожих на описание принципа метода ПЦР, но они, по-видимому, так и не проверили эту идею экспериментально.)[28]
Тем не менее докладом Муллиса никто не восхитился, на лабораторном семинаре в компании Cetus его едва слушали. К счастью, идеей заинтересовался один из двух лаборантов, Фред Фалуна, и с его помощью Кэри решил попытаться амплифицировать 400-нуклеотидный фрагмент ДНК человека – участок гена фактора роста нервов. (“Амплифицировать” как раз и значит “сделать множество копий этого участка”.) Муллис оптимистично предполагал, что этот ген может состоять из одного экзона и его удастся выцепить из цельной ДНК человека, без всякой возни с клонированием и колониями, с помощью реакции, которую он только что придумал.
Единственным человеком, кроме Фалуны, который разделял энтузиазм Кэри Муллиса летом 1983 г., был Рон Кук, основатель компании Biosearch – той самой, которая вывела на рынок первую коммерчески успешную машину для синтеза ДНК. Может, потому, что это было хорошо для его бизнеса, или потому, что он был рациональным химиком с неповрежденным мозгом, саркастически замечал Муллис в своей Нобелевской лекции. Именно Кук посоветовал ему, коль скоро никто в Cetus не принимает его идею всерьез, не делиться с нанимателями результатом, который не связан напрямую с его обязанностями, а самостоятельно довести ее до ума и самому запатентовать. Но Муллис сомневался, что это возможно, и ответил, что ему нравится Cetus и что компания его, конечно же, не обидит, если идея принесет прибыль.
В сентябре Кэри поставил первый опыт с геном фактора роста нервов: добавил в пробирку с человеческой ДНК праймеры и полимеразу и оставил ее на 12 часов. Но когда он провел электрофорез, никакой полосы, соответствующей фрагменту длиной 400 нуклеотидов, не появилось.
Пришлось признать, что реакция не будет совсем уж простой. Дело в том, что двунитевая ДНК распадается на две свободные нити при определенной температуре (94–95° С), а комплементарные нити слипаются, подобно половинкам застежки-молнии, при низкой (желательно не выше 68° С). Для описания этих процессов молекулярные биологи заимствовали термины из металлургии, двунитевая ДНК у них “плавится”, коротенькие праймеры “отжигаются” на свободную нить[29].
Конечно, живая клетка не должна нагреваться и остывать каждый раз, как захочет копировать свою ДНК, – в клетке расплетание и заплетание двойной спирали обеспечивают специальные белки. Но в пробирке проще действовать чистой физикой, чем добавлять все эти белки.