После многих приключений и разгадывания искусствоведческих шарад силы добра находят место, откуда уже вырвалась или вот-вот должна вырваться страшная инфекция. Место это в уютной пещере, посещаемой туристами, в подземном озере. Далее цитата.
“Каков теперешний радиус распространения инфекции?
Брюдер знал, что ответ будет получен через считаные минуты. Его группа уже установила на мостках на разных расстояниях от эпицентра переносные устройства для обнаружения вируса. Эти устройства – приборы ПЦР – основаны на так называемой полимеразной цепной реакции.
Агент Брюдер сохранял надежду. Поскольку вода в подземном озере стоячая и времени прошло очень мало, можно было рассчитывать, что приборы ПЦР зафиксируют заражение сравнительно небольшой зоны, которую затем удастся дезинфицировать химикалиями и отсасывающими воду устройствами.
– Готовы? – спросил через мегафон техник.
Агенты в разных местах водохранилища утвердительно подняли большие пальцы.
– Проверяйте образцы, – треща, скомандовал мегафон.
По всему подземному залу аналитики склонились к приборам ПЦР. Каждый прибор приступил к анализу образца воды, взятого в одной из точек на концентрических дугах вокруг таблички Зобриста.
Все затихли в ожидании, молясь о том, чтобы загорелись только зеленые лампочки.
А потом началось.
На ближайшем к Брюдеру приборе замигала красная лампочка, сигнализирующая о наличии вируса. Мышцы Брюдера напряглись, и он перевел взгляд на следующий прибор.
Он тоже замигал красным.
Нет…”[38]
Спрашивается: откуда у чиновников ВОЗ специфические праймеры к абсолютно неизвестному, супертаинственному возбудителю? Настолько специфические, что сразу ясно, с одного красного огонечка: он самый, и мы все умрем? Можно, конечно, использовать праймеры к консервативным участкам, которые встречаются в геномах многих вирусов (пусть будет вирус, а не бактерия). Тогда мы получим сигнал, если в пробе присутствует любой из этих вирусов. Однако неудивительно, что в месте, где постоянно ходят толпы сопливых туристов, есть какие-то вирусы. Да, в воде их немного, но в том и прелесть ПЦР, что она делает различимый сигнал из следовых количеств нуклеиновых кислот. Так что, похоже, обманывали профессора Лэнгдона не только симпатичные девушки и тайные агенты. Всемирная организация здравоохранения сама была в курсе коварного замысла, даже геном возбудителя имела! Или автор чего-то не понял про ПЦР. Зато он много знает об истории искусства, в отличие, например, от меня.
Вот такое у ПЦР граничное условие: знать фланкирующие последовательности, то есть конец и начало интересующего участка. И в конце ХХ в., когда читали геном человека, фрагменты клонировали в векторах (сотрудники Крейга Вентера, которые работали с короткими фрагментами, – даже в обычных бактериальных плазмидах). А к последовательностям в векторе уже можно применять ПЦР: даже если вставку никто еще не читал, последовательность плазмиды, в которую она вставлена, известна.
С другой стороны, по мере того как развивается геномика (так назвали раздел науки, которая изучает уже не только отдельные гены, но целые геномы), нечитанных последовательностей в природе все меньше. Теперь ПЦР нашла применение и в палеогеномике. Если мы знаем, какому зверю (или человеку, брату Homo sapiens) принадлежит ископаемая кость, можно синтезировать праймеры, основываясь на геноме родственного вида.
И даже если мы этого не знаем – все равно можно попробовать. Гены, кодирующие рибосомную РНК, имеются у всего живого, при этом эволюция вносит в них изменения крайне осторожно и деликатно. Рибосомы – те самые штуки, которые синтезируют белки, и слишком смелые инновации в рибосомных генах могут привести к потере этой крайне необходимой для жизни способности. Поэтому можно вытянуть с помощью ПЦР рибосомный ген неизвестного существа и, сравнив его с известными последовательностями других существ, сделать довольно точные выводы о том, на какой веточке эволюционного древа сидел тот, кому принадлежала кость.
Полимеразная цепная реакция позволяет “снимать копии” с крайне малого количества ДНК – сотен, а то и десятков пикограммов, то есть геномов горсточки клеток. Из считанных молекул, содержащихся в образце, можно получить количество, достаточное для анализа. Теперь уликой в уголовном деле может стать и капля крови, и несколько волосков (с волосяными луковицами), а личность убитого можно установить даже по фрагменту кости.
Сегодня существует множество вариантов ПЦР для самых разных надобностей[39]. Можно проводить реакцию с несколькими парами праймеров в одной пробирке, можно амплифицировать фрагменты длиннее 5000 пар нуклеотидов. Хитроумный способ, включающий нарезание исходной ДНК на куски и их закольцовывание, позволяет получить копии последовательности, которая в линейной ДНК была справа и слева от известных праймеров, а не между ними (это нужно, например, чтобы понять, в какое место человеческой ДНК встроил свой геном вирус). Можно запустить полимеразную реакцию внутри целых живых клеток в культуре, а потом с помощью гибридизации показать, где находится искомая нуклеотидная последовательность… Много чего можно. В настоящее время ПЦР – трудолюбивая рабочая лошадка молекулярной биологии, ее гоняют и в хвост и в гриву. Кстати, и большинство методов высокопроизводительного секвенирования с необходимостью включают в себя полимеразную цепную реакцию на этапе подготовки библиотек ДНК-фрагментов. И так будет по крайней мере до тех пор, пока не победят методы, работающие с единичными молекулами, вроде нанопорового секвенирования. То есть еще долго. Нельзя исключать, что на смену классической ПЦР придут другие методы амплификации ДНК – но и они, скорее всего, будут так или иначе использовать принцип, придуманный майской ночью на трассе 128.
Выделить главное
Теперь опять вернемся к человеческой ДНК, Алеку Джеффрису, криминалистике и определению отцовства. Те самые участки с повторяющимися последовательностями, которые Алек Джеффрис в своих первых экспериментах искал среди рестрикционных фрагментов, мы легко можем получить с помощью ПЦР. И на форезе тогда будет не “всеобщая смазь”, какую мы видели в первых опытах, а четкие отдельные полоски.
Мы помним, что одна из самых серьезных проблем ДНК-фингерпринта в криминалистике – малые количества доступной ДНК и высокая вероятность ее деградации в неидеальных условиях места преступления. Эти проблемы помогла решить, во-первых, полимеразная цепная реакция, а во-вторых, выбор других маркеров. Вместо гипервариабельных минисателлитов (VNTR) начали использовать микросателлиты, они же короткие (простые) тандемные повторы, они же STR (short tandem repeat, simple tandem repeat). И по сей день ученые и криминалисты всех цивилизованных стран пользуются стандартными методиками для исследования STR-локусов.
Чем хороши STR? Именно тем, что они короткие: длина этих участков – около 100 н. п., а не тысячи, соответственно, больше вероятность, что удастся отыскать их целыми, неповрежденными, и ПЦР ставить удобно. А все остальное работает так же, как и с VNTR: от количества повторов зависит длина сравниваемых участков, и она-то различается у разных людей. Чем больше таких участков – STR-локусов – используют для сравнения двух образцов, тем выше достоверность заключения.
Допустим, в конкретном месте генома (локусе) у разных людей может быть от 1 до 11 копий STR. Поскольку набор хромосом у человека двойной, все гены и межгенные участки у каждого из нас представлены в двух экземплярах (необязательно идентичных). Разные варианты одного участка называют аллелями, а множество всех вариантов с различным числом повторов – аллельной лестницей. Например, у мамы могут быть аллели 5–6 (в одной хромосоме 5 копий STR, в другой 6) а у папы 6–8 (в одной хромосоме 6, в другой 8). Ребенок получает одну хромосому от отца, другую от матери, следовательно, у данной пары могут быть дети с аллелями 5–6, 5–8, 6–6 или 6–8. Если же у ребенка 5–5, значит, папа – не папа.
Вот почему в отчетах по установлению родства методом ДНК-фингерпринта мы видим пары чисел: каждое число – это количество повторов у данного человека в данном локусе. Если у человека в обеих хромосомах в этом месте одинаковое количество повторов, то есть и от мамы, и от папы он получил по 6 повторов (он гомозиготен по этому аллелю, говорят генетики), тогда вместо пары чисел может быть одно число.
Как отмечает сам Алек Джеффрис, его удивило, что потребовалось еще пять лет, чтобы типирование по STR окончательно вытеснило старые методы. Были найдены участки с четырехнуклеотидными повторами, дававшие более четкую картину, мультиплексная ПЦР (это когда в реакционную смесь добавляют не одну пару праймеров, а несколько) позволила идентифицировать сразу несколько участков в одном образце, а использование флуоресцентных праймеров дало возможность автоматизировать процесс.
Очень скоро это стало государственным делом, и первой была, естественно, Великобритания. В апреле 1995 г. британский министр внутренних дел Майкл Ховард объявил об основании Национальной базы данных ДНК (National DNA Database, NDNAD) – первой в мире государственной базы ДНК-профилей преступников. К июлю 2005 г. в ней были 2,9 млн ДНК-профилей и образцов ДНК. Эта база данных с самого начала помогала расследовать не только страшные преступления, но и сравнительно мелкие – оказалось, что и кражу автомобиля совсем нетрудно раскрыть, если на руле найдется ДНК человека, которому владелец одолжить машину никак не мог. Другие страны инициировали аналогичные программы. Раскрываемость с использованием ДНК-анализа и базы данных ДНК-профилей сразу же пошла вверх.
В 2003 г. в Великобритании был принят закон, согласно которому в базе данных должна оставаться ДНК не только осужденных, но и подозреваемых. С точки зрения полиции, правильный закон: под подозрение обычно попадают не ангелы, а такие персоны, которые, даже если не совершили этого конкретного преступления, с высокой вероятностью совершили или совершат другое. Войдут ли когда-нибудь в эти базы все граждане, в том числе самые законопослушные, – спорный вопрос, к которому мы еще вернемся. Кстати, мы уже достаточно знаем о фингерпринте, чтобы понять следующее: ДНК-профиль в базе данных может указать не только на самого человека, но и на его ближайших родственников, то есть можно установить, что ДНК с места нового преступления пр