Много лет назад мной было доказано, что иммунитет по отношению к вибрионам, холерному и птичьему (Мечниковскому), может быть вызван перегонами соответственных культур. Эти опыты были в свое время подтверждены Эрнандесом и Брюлем, а недавно Ермольевой. Эти же вакцинирующие вещества были выделены из вибрионных культур общими методами нахождения птомаинов. Оказалось, кроме того, что эти вещества не ядовиты и дают немедленный иммунитет – без инкубации, вследствие чего могут применяться и для лечения инфекции; они вакцинируют и при энтеральном введении.
Затем я нашел, что у вакцинированных летучими вакцинами животных отсутствуют обычные антитела – бактерицидные, агглютинирующие и преципитирующие, но что сыворотка их обладает превентивными свойствами, т. е. способна передавать иммунитет свежим животным. Ввиду этого так называемые иммунитетные реакции не имеют в сущности непосредственного отношения к иммунитету, а только иногда сопутствуют ему (сообщение на VII съезде бактериологов).
Эти факты, как мне кажется, противоречат теории рецепторов. Но последняя и без того является поколебленной, так как предполагает предсуществование в тканях всевозможных рецепторов, что в высшей степени мало вероятно. Она в настоящее время заменяется первоначальной бюхнеровской теорией – образования антител из антигенов. В сыворотке крови нормальных животных имеется способность влиять на бактерий, и она приобретает специфические свойства, соединяясь с соответственными бактериальными продуктами. От характера этих последних зависит появление тех или иных антител. В случае летучих вакцин сыворотка вакцинированных обладает только превентивной способностью, которая является единственным существенным признаком приобретенного иммунитета. Это ее свойство обнаруживается не in vitro, а только в живом организме (феномен Пфайфер). Это указывает, как я думаю, на участие в уничтожении микробов при помощи специфической сыворотки еще второго фактора, а именно белых шариков крови. Действуют ли они при этом как фагоциты или же путем выделения разрушительных веществ, как доказывает Люмсден для ракового иммунитета, остается пока нерешенным. При таком объяснении роль превентивной сыворотки заключается в привлечении к месту инфекции иммиграции лейкоцитов. Но уже Pasteur по поводу куриной холеры указал на местную реакцию и на скопление лейкоцитов у вакцинированных животных в отличие от неприметных явлений (или отека, как было найдено мной в целом ряде инфекций) у вопсриимчивых.
Предложенный краткий очерк моих взглядов на приобретение иммунитета под влиянием летучих вакцин имеет целью обратить внимание на работы, разбросанные на протяжении многих десятков лет, находящиеся в малодоступных изданиях и не нашедшие пока откликов в специальной литературе.
Между тем, как мне кажется, неоспоримое доказательство того, что некоторые по крайней мере из вакцин не относятся к белкам, имеет и практическое значение, так как дает основание искать фармакологические средства среди бактерийных биогенных аминов. Если растительное царство дало так много полезных алкалоидов, то весьма вероятно, что их можно также найти и в мире бактерий. Небелковые вещества важны тем, что, не вызывая образования антител, они не встречают помехи своему действию.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ehrlich. Handbuch der Technik und Metodik der Immunitätsforschung, 1.
2. Landsteiner. Klinische Wochenschrift, 1927, N. 3.
3. Гамалея. Annales de 1’Institut Pasteur, 1889; Arch. de medecine experiment., 1822.
4. Comptes Rendus de la Societe de Biologie, 1891.
5. Comptes Rendus de la Societe de Biologie, 1891.
6. Ермольева 3. Сообщение на X съезде бактериологов, 1926.
7. Гамалея. Известия Комиссариата здравоохранения, 1918, № 1; Профилактическая медицина, 1922, № 4–5.
2. Гамалея. Научная медицина, 1919, № 4–5.
3. Mez und Ziegenspeck. Botan. Arch., 1925, 12.
4. Lancet, 15 January 1927.
Новые исследования о дифтерийном токсине
1923 г.
В последнее время появилось несколько работ, освещающих до сих пор не решенный вопрос о природе дифтерийного токсина. Со времени моих исследований (1892), много раз впоследствии подтвержденных, считается доказанным его белковый состав. Более же точное его определение, а также способ его происхождения оставались невыясненными. По последнему вопросу было высказано три мнения: Ру и Иерсен считали его секретом дифтерийной бактерии, я искал его источник в бактерийных телах, а по третьей гипотезе, высказанной Бригером и другими по поводу ядов бактерий вообще, токсин являлся продуктом разложения составных частей культуральной среды.
Вальбум недавно сообщил о следующих фактах. Если прибавить к готовому токсину чистого стерильного бульона, то токсичность смеси возрастает. Точно так же количество токсина увеличивается, если к снятым с поверхности культур дифтерийным палочкам прибавить чистого бульона. Вальбум объяснил эти результаты предположением, что дифтерийные бактерии выделяют протоксин, который от действия каких-либо веществ в бульоне превращается в токсины. Предположение о протоксине уже раньше было высказано Моргенруен и Пале (1906).
Дернби же на основании своих опытов с действием трипсина на токсин (1922) пришел к мысли, что токсин получается в результате переваривания альбумоз бульона.
Для проверки этих мнений Дернби и Вальбум произвели сообща очень обстоятельные и крайне интересные исследования о появлении и накоплении токсина в дифтерийных культурах. Они пользовались двумя токсическими штаммами: «Парк Вильямс № 8» (PW8) и шведским «Клине Б». Как дающие хороший выход токсина применялись бульоны по Вальбуму и по Давид – Дернби. Первый: 10 кг свежей телятины измельчают и разбалтывают в 10 л нагретой до 37° воды, засевают 30 см3 24-часовой культуры Bact. coll и оставляют на ночь в термостате, затем кипятят, отжимают мясо, наливают еще 10 л воды, снова кипятят и отжимают. Смешивают оба экстракта, прибавляют 1,5 % пептона Витте, 0,5 % поваренной соли, 0,1 % глюкозы, подщелачивают нормальным раствором едкого натра до pH 7,4–7,6 и стерилизуют в автоклаве, причем pH падает до 7,1–7,4.
По Давид – Дернби: 10 кг свежей телятины измельчают и заливают 20 л воды. После прибавления 200 г прессованных дрожжей оставляют на 6 – 10 часов бродить в термостате, нейтрализуют нормальным едким натром и прибавляют 5 г трипсина. Оставляют на ночь при 37°, кипятят, фильтруют и отжимают мясо, к экстракту прибавляют 1,5 % пептона Витте, 0,5 % NaCl, доводят до pH 7,0–7,2 и стерилизуют в автоклаве.
Сходные, впрочем, результаты получены и с бульоном Мартина, а также с Дугласовским, который они особенно рекомендуют для производства токсина в больших размерах ввиду его дешевизны. 150 г измельченной конины смешивают с 250 см3 воды и нагревают до 80°, затем: прибавляют 250 см3 0,8 % раствора соды и понижают температуру до 45°, прибавляют 5 см3 хлороформа и 1 г трипсина и оставляют смесь на 6 часов при 37°. Прибавляют соляной кислоты до pH 8, нагревают полчаса для удаления хлороформа и фильтруют. Разливают по колбам и стерилизуют.
Вальбум и Дернби окончательно устанавливают, что состав бульона, а именно наличность в нем пептона и альбумоз, имеет первенствующее значение для выхода токсина. Хотя, как это в свое время было доказано опытами в лаборатории Страуса, токсин получается и в безбелковой среде – за счет составных частей самих бактерий, но его количество ничтожно, а для образования больших количеств необходимо присутствие тех продуктов разложения белков, которые получаются в результате начала действия вторичных протеаз, т. е. триптаз, дальнейшее же переваривание альбумоз и распадение их на аминокислоты лишают соответ- ствущий бульон способности давать выход токсина. Изучая параллельно размножение бактерий в культурах, изменение их реакции, содержание бактерий в культурах, изменение их реакции, содержание в них белков, альбумоз и аминокислот наряду с нарастанием и упадком токсичности, Дернби и Вальбум пришли, между прочим, к следующим выводам. Дифтерийные [культуры] обнаруживают протеолитическое действие, параллельно которому уменьшается концентрация водородных [ионов?]. В первой стадии протеолиза токсичность растет, достигает максимума и затем падает, вероятно вследствие продолжающегося протеолиза. Для хорошего роста дифтерийных бацилл нужны продукты распада белков, в большем количестве. Но для получения сильного токсина необходимы альбумозы или сложные пептиды, те же пептоны (Шапото), которые состоят из глубоко разложенных производных, обеспечивают хороший рост, но плохой выход токсина. Ослабление токсина при кислой реакции есть отчасти резервибельный процесс. Протеолитический фермент, как трипсин, эрепсин, триптаза из дрожжей, лейкоцитов, Вас. prodygino, Вас. pyocyaneus и смесь дифтерийных бактерий быстро уничтожают токсин. Триптаза дифтерийных бацилл не столько выделяется в бульон, сколько содержится в телах бактерий. Применение опыта Вальбума с нарастанием токсичности при прибавлении свежего бульона к густому токсину или измельченным бактериям снова подтверждено. Липоиды, извлекаемые петролейным эфиром из токсина или из бактерий, не ядовиты. Все приводимые факты были объяснены следующим предположением. Токсин происходит главным образом вследствие протеолиза альбумоз специфическими протеазами, выделяющимися из трупов автолизируемых бактерий. Эти протеазы разлагают альбумозы и пептоны, бульона и самих бактерий на более простые соединения. Промежуточные продукты этого разложения и являются токсином, который разлагается и уничтожается дальнейшим протеолизом. В конечном итоге токсин, таким образом, должен быть отнесен к полипептидам (Bioch. Ztschr., т. 130, тетрадь 4–6).
Интересным дополнением к изложенным исследованиям представляется появившаяся несколько раньше (Bioch. Ztschr., т. 130, тетрадь 1–3) работа Дрейера. Он приготовлял токсин на плацентарном бульоне и нашел, что постепенным прибавлением кислоты к токсическому фильтрату вызывается появление мути, которая при отстаивании дает осадок. Этот осадок заключает в себе весь токсин, как можно убедиться, растворив его в слабой щелочи. Это открытие позволяет получать токсин в более чистом и очень концентрированном виде. Кроме того, Дрейер доказал, что наибольшую ядовитость токсин (при ремеровском титровании) обнаруживает при pH от 8,6 до 8,8. Поэтому он различает наличную (actuelle) токсичность от абсолютной. Вторая получается при доведении реакции до оптимальной. На основании своих исследований Дрейер, так же как и Дернби и Вальбум, относит дифтерийный токсин к полипептидам. Близкое отношение к предыдущим работам имеет найденная Рамоном (Sos de Biol, 1923, № 10 и 49) реакция токсина с антитоксином. Он доказал, что сильный токсин дает с антитоксином осадок, который действует на организм так же, как и смесь, из которой он был получен. Он нашел, кроме того, что токсичность свежих культур и способность их преципитироваться антисывор