. Эти длинные нкРНК могут действовать подобно приманке. Они остаются привязанными к той области генома, где были продуцированы, и притягивают к себе репрессивные ферменты для подавления экспрессии генов.
Это происходит по той причине, что в комплексах репрессивных ферментов содержатся белки, подобные EZH2, которые способны связываться с ДНК.
Ученые любят выстраивать теории, и одна из них, весьма привлекательная, была предложена и для длинных нкРНК. Выдвигалась гипотеза, что они связываются с областями, с которых транскрибируются, и подавляют экспрессию генов на этой же самой хромосоме. Но если мы вернемся к нашей аналогии, с которой начиналась эта глава, то должны будем признать, что уже построили маленький симпатичный домик и нагромоздили на его крышу довольно много мусора.
Есть такое примечательное семейство генов, которые называются генами НОХ. Когда у плодовых мушек эти гены мутируют, то в результате появляются невероятные фенотипы, например с лапками, растущими на голове[135]. Одна из длинных нкРНК под названием HOTAIR регулирует область генов, известную как пучок НОХ-D. Подобно длинной нкРНК, которую исследовала Джинни Ли, HOTAIR связывается с комплексом PRC2 и создает хроматиновый регион, отмеченный репрессивными гистоновыми модификациями. Но HOTAIR не транскрибируется с позиции НОХ-D на хромосоме 12. На самом деле она кодируется в другом пучке генов, называемом НОХ-С, на хромосоме 2[136]. И никому не известно, как и почему HOTAIR связывается с позицией HOX-D.
Подобная загадка существует и в отношении Xist — наиболее изученной из всех длинных нкРНК. нкРНК Xist распространяется почти по всей репрессированной хромосоме X, но нам неизвестно, каким образом она это делает. Молекулы РНК обычно не обволакивают хромосомы. Нет никаких очевидных причин, по которым РНК Xist могла бы таким образом связаться с хромосомой, но нам известно, что это не имеет никакого отношения к последовательности хромосомы. Эксперименты, о которых рассказывалось в предыдущей главе (где Xist могла подавить всю аутосому при условии, что она обладала центром репрессии X), подтвердили, что Xist, оказавшись на хромосоме, просто продолжает перемещаться по ней. Ученые в большинстве своем по-прежнему недоумевают по поводу таких фундаментальных характеристик этой наиболее полно изученной из всех нкРНК.
А вот и еще один удивительный факт. До самого недавнего времени ученые считали, что все нкРНК подавляют экспрессию генов.
В 2010 году профессор Рамин Шикхаттар из Института Уистара в Филадельфии идентифицировал в некоторых типах клеток человека свыше 3 000 длинных нкРНК. Эти длинные нкРНК демонстрировали различные схемы экспрессии в разных типах клеток, а это заставляло предположить, что им отведены особые роли. Профессор Шикхаттар с коллегами исследовали небольшое количество длинных нкРНК с целью определения их функций. Они воспользовались проверенными и надежными экспериментальными методиками для подавления экспрессии тестируемых нкРНК, а затем проанализировали экспрессию соседних с ними генов. Предполагаемые и реальные результаты этого эксперимента показаны на рисунке 10.2.
Рис. 10.2. Считалось, что нкРНК подавляют экспрессию генов-мишеней. Если бы эта гипотеза была верна, то понижение экспрессии определенной нкРНК привело бы к повышению экспрессии этого гена, так как его репрессия уменьшилась. Это продемонстрировано в центре схемы. Однако, как выяснилось, большое число нкРНК в действительности усиливают экспрессию своих генов-мишеней. Это подтверждается экспериментами, в ходе которых понижение экспрессии нкРНК привело к результатам (см. на рис. справа)
Протестировав двенадцать нкРНК, в семи случаях ученые получили результаты, показанные справа. Это противоречило ожиданиям, поскольку, как оказалось, около 50 процентов длинных нкРНК могут на самом деле повышать экспрессию соседних генов, а не понижать ее[137].
Авторы статьи, в которой описывались эти эксперименты, однозначно заявили: «Точный механизм, с помощью которого наши нкРНК способны усиливать экспрессию генов, неизвестен». И с этим мнением трудно не согласиться. Оно заслуживает уважения, так как недвусмысленно дает понять, что на настоящий момент мы просто не представляем себе, как это происходит. Работа Рамина Шикхаттара убедительно продемонстрировала, что о длинных нкРНК наука знает еще очень мало, поэтому не следует спешить с принятием новых теорий.
Не менее осмотрительны должны мы быть и в предположении, что все решает размер и что чем он больше, тем лучше. Несомненно, что длинные нкРНК играют важную роль в функциях клетки, но есть и другой, не менее важный класс нкРНК, оказывающий на клетку существенное влияние. Принадлежащие к этому классу нкРНК короткие (длиною обычно в 20-24 основания), и их мишенями являются не ДНК, а молекулы мРНК. Впервые они были обнаружены у уже полюбившихся нам червей С. elegans.
Как мы уже говорили, С. elegans представляет собой очень удобную системную модель, потому что нам точно известно, как должны развиваться все его клетки. Временные рамки и последовательность различных стадий развития очень жестко отрегулированы. Одним из ключевых регуляторов является белок под названием LIN-14. Ген LIN-14 экспрессируется очень активно (продуцируя белок UN-14 в больших количествах) на самых ранних стадиях эмбрионального развития, но подвергается понижающей регуляции, когда из личиночной стадии 1 червь переходит в личиночную стадию 2. Если ген LIN-14 мутирует, нарушаются временные рамки прохождения различных стадий развития. Если белок LIN-14 продолжает вырабатываться слишком долго, червь начинает повторять ранние стадии развития. Если продукция белка UN-14 прекращается слишком рано, червь преждевременно переходит на более поздние личиночные стадии. В любом случае, его нормальное развитие становится невозможным.
В 1993 году две работавшие независимо друг от друга лаборатории продемонстрировали, как контролируется экспрессия LIN-14[138][139]. К всеобщему удивлению оказалось, что ключевым фактором этого процесса было связывание короткой нкРНК с молекулой мРНК LIN-14. Это показано на рисунке 10.3. Это пример посттранскрипционного сайленсинга (глушения) гена, при котором мРНК вырабатывается, но не может продуцировать белок. Это совершенно иной способ контроля экспрессии генов в отличие от того, каким пользуются длинные нкРНК.
Рис. 10.3. Схематическое изображение того, как экспрессия микроРНК на определенных стадиях развития можетрадикально изменить экспрессию гена-мишени
Важность этой работы заключается в том, что она заложила фундамент для совершенно новой модели регуляции экспрессии генов. Короткие нкРНК, как нам теперь известно, являются механизмом, которым пользуются организмы всего растительного и животного мира для контроля экспрессии генов. Существуют разнообразные виды коротких нкРНК, но мы уделим внимание в основном микроРНК (миРНК).
В клетках млекопитающих идентифицировано, по меньшей мере, 1 000 различных миРНК. В длину миРНК насчитывают около 21 нуклеотида (основания), иногда они могут быть чуть длиннее или короче, и большинство из них выступают, как представляется, в роли посттранскрипционных регуляторов экспрессии генов. Они не останавливают продукцию мРНК — вместо этого они регулируют ее «поведение». Обычно для этого они связываются с нетранслируемой областью 3’ (3’ НТР) молекулы мРНК. Эта область показана на рисунке 10.3. Она присутствует в зрелой мРНК, но не кодирует никакие аминокислоты.
Когда геномная ДНК копируется для продукции мРНК, оригинальный транскрипт обычно бывает очень длинным, поскольку он содержит в себе и экзоны (которые кодируют аминокислоты), и интроны (которые аминокислоты не кодируют). Как мы узнали из главы 3, интроны удаляются во время сплайсинга для продукции мРНК, кодирующей белок, но при описании этого процесса в главе 3 мы кое-что опустили. На РНК есть такие участки — в ее начале (называемый 5’ НТР) и в конце (3’ НТР), — которые не кодируют аминокислоты, но также и не сплайсируются, подобно интронам. Напротив, эти некодирующие области сохраняются на зрелой мРНК и действуют как регуляторные последовательности. Одна из функций 3’ НТР, в частности, состоит в том, чтобы связывать регуляторные молекулы, включая миРНК.
Как миРНК связывается с мРНК, и что происходит после этого? миРНК и 3’ НТР мРНК взаимодействуют только в том случае, если узнают друг друга. Для этого они пользуются спариванием оснований, довольно подобным тому, что мы встречали на двойных цепочках ДНК. Г может связаться с Ц, А может связаться с У (место Т в РНК занимает У). Хотя длина миРНК обычно составляет 21 основание, совсем не обязательно весь ее набор из 21 нуклеотида должен соответствовать мРНК. Ключевая область на миРНК занимает положение от 2 до 8.
Иногда соответствие на позициях от 2 до 8 оказывается не идеальным, но достаточно близким для того, чтобы две молекулы образовали пару. В таких случаях связывание миРНК препятствует трансляции мРНК в белок (именно это и произошло в ситуации, показанной на рис. 10.3). Если же соответствие полное, связывание миРНК с мРНК инициирует разрушение мРНК ферментами, прикрепленными к миРНК[140]. Пока нам еще не ясно, влияют ли позиции с 9 по 21 на миРНК менее непосредственным образом на то, как эти маленькие молекулы определяют свои мишени и к чему оно приводит. Однако мы знаем совершенно точно, что единственная миРНК может регулировать более чем одну молекулу мРНК. Из Главы 3 мы узнали, что один ген способен кодировать множество различных молекул белка, меняя способы сплайсирования матричной РНК. Единственная миРНК может одновременно оказывать влияние на многие из этих по-разному сплайсированных версий. Кроме того, единственная миРНК способна влиять и на совершенно неродственные белки, закодированные разными генами, но имеющие похожие последовательности 3’ НТР.