Эволюционная история популяции Ara-3, в которой бактерии научились питаться цитратом. Числа слева — поколения. Кружками на дереве обозначены 29 клонов, чьи геномы были отсеквенированы. На дереве выделяются пять основных клад (эволюционных линий): UC (unsuccessful clade, быстро вымершая ранняя линия), клада 1, клада 2, клада 3 («потенцированные» клады с повышенной вероятностью появления фенотипа Cit+, т. е. способности питаться цитратом), новая клада Cit+— клада, способная питаться цитратом, произошедшая от клады 3 после 31 тыс. поколений (Появление Cit+). После 33 тыс. поколений у бактерий Cit+ появилась мутация, резко повышающая темп мутагенеза (Появление мутатора). В верхней части рисунка показаны результаты повторных эволюционных экспериментов с замороженными представителями клад 1, 2 и 3. Представители клады 1 выработали фенотип Cit+ в двух случаях из 55 попыток, клады 2 — в двух случаях из 97, клады 3 — в восьми случаях из 37. Представители исходного предкового штамма имеют пренебрежимо малую вероятность появления фенотипа Cit+. График справа внизу показывает темп накопления мутаций, резко увеличившийся у бактерий Cit+ (светло-серые кружки) после появления аллеля-мутатора. Из Blount et al., 2012.
Приобретение фенотипа Cit+ во всех случаях было связано с тем, что ген citT начинал экспрессироваться в аэробных условиях. Но достигался этот результат разными путями. В некоторых повторных опытах, как и в основном долгосрочном эксперименте, произошли тандемные дупликации[55], благодаря которым citT оказался под управлением аэробного промотора. Но границы дуплицированных участков в разных случаях были разными, а промотор, взявший на себя управление геном citT, не всегда был промотором гена rnk: в одном случае это был промотор другого гена (rna). В нескольких повторных опытах тот же эффект был достигнут без дупликации — благодаря встраиванию мобильного генетического элемента IS3 в кодирующую часть гена, расположенного по соседству с citT. В этом мобильном элементе как раз имеется подходящий промотор, взявший на себя управление геном citT.
Повторные эксперименты подтвердили, что вероятность приобретения признака Cit+ росла в ряду «предковый штамм — клады 1 и 2 — клада 3». Стало быть, появление этого признака именно в кладе 3 не было простой случайностью. Микробы были заранее подготовлены к этому — «потенцированы». Иными словами, у них в ходе предшествующей эволюции зафиксировались какие-то мутации, которые сами по себе не давали возможности питаться цитратом, но повысили вероятность развития этой способности в будущем. Разумеется, «потенцирующие» мутации зафиксировались не потому, что микробы планируют свою эволюцию наперед. Эти мутации либо были нейтральными и зафиксировались случайно, либо были полезны для чего-то другого. Подготовка к цитратному питанию была побочным эффектом, которого естественный отбор не мог предусмотреть.
Дупликация, которая привела к появлению способности питаться цитратом у бактерий из популяции Ara-3. а — участок хромосомы предкового штамма, б — тот же участок после дупликации. Стрелками и петельками обозначены промоторы генов rna и rnk, обеспечивающие работу этих генов в аэробных условиях. В результате дупликации ген citT, кодирующий транспортер цитрата, оказался под управлением промотора гена rnk и стал экспрессироваться в присутствии кислорода. Из Blount et al., 2012.
Следующими экспериментами удалось доказать, что какие-то генетические особенности клады 3 действительно способствуют эффективному питанию цитратом. Чтобы убедиться в этом, исследователи вставили в геномы представителей предкового штамма и клад 1–3 по несколько копий гена citT под управлением аэробного промотора. Иными словами, они придавали микробам способность поглощать цитрат — и смотрели, насколько микробы расположены к новой диете.
Представители всех генно-модифицированных штаммов в результате научились использовать цитрат в пищу, но в очень разной степени. Микробы из клады 3 делали это лучше всех: они быстро переключались с глюкозы на цитрат и хорошо росли на чистом цитрате. Микробы из клад 2 и 1 справлялись хуже: им требовалось больше времени на переключение, и росли на цитрате они медленнее. Предковый штамм использовал цитрат еще менее эффективно. Для того чтобы после исчерпания запасов глюкозы переключиться на питание цитратом, ему требовалось около двух суток. Между прочим, это означает, что в условиях долгосрочного эксперимента он не получил бы никакого преимущества от мутации, которая создала фенотип Cit+ в кладе 3: никто не дал бы ему двух суток на раздумья, ведь бактерий пересаживают в новую среду с глюкозой каждые сутки.
Эти результаты, как и повторные эволюционные эксперименты, показывают, что «потенцирование» проходило как минимум в два этапа. Вероятность формирования фенотипа Cit+ выросла при переходе от предкового штамма к кладам 1 и 2 и снова увеличилась при формировании клады 3.
Интересно, что первые бактерии, у которых после поколения № 31 000 был зарегистрирован фенотип Cit+, использовали цитрат еще очень неэффективно, хотя у них уже были и «потенцирующие» мутации, и тандемная дупликация. Новая функция поначалу была несовершенна и давала лишь едва заметное преимущество. В ходе дальнейшей эволюции эффективность использования цитрата микробами Cit+ быстро росла. Исследователям удалось расшифровать один из механизмов усовершенствования: фрагмент ДНК с активированным геном citT просто-напросто подвергся еще нескольким дупликациям. Это, по-видимому, ускорило поглощение цитрата из внешней среды.
Таким образом, формирование эволюционного новшества происходило в три этапа. На первом этапе (потенцирование) закрепились мутации, повысившие вероятность появления признака в будущем. На втором этапе (актуализация) появилась и была поддержана отбором ключевая мутация, превратившая микробов Cit− в Cit+. Правда, поначалу новый признак был слабо выражен и почти не приносил пользы. На заключительном, третьем этапе (усовершенствование) признак постепенно оптимизировался. В результате его полезность многократно выросла.
Усовершенствование — процесс, который может продолжаться долго. Однако события, происходившие в популяции Ara-3 после поколения № 35 000, трудно анализировать. В это время среди микробов Cit+ (как и во многих других подопытных линиях) распространилась мутация, повышающая скорость мутагенеза в 20 раз, — уже знакомый нам аллель-мутатор. Найти среди сотен новых мутаций те, что связаны с усовершенствованием цитратного питания, — задача пока слишком трудная. Впрочем, замороженные бактерии никуда не спешат и будут спокойно ждать появления новых методов и приборов (Blount et al., 2012).
Разные пути, ведущие к одной цели
Долгосрочный эксперимент Ленски и его коллег — далеко не единственное исследование такого рода. В последние годы многие микробиологи заинтересовались изучением «эволюции в пробирке». Задачи при этом решаются самые разные. Вот, например, такая: сколько разных путей ведет к одной и той же эволюционной «цели»? Если взять много одинаковых популяций и заставить их приспосабливаться к одинаковым условиям, приспособятся ли они за счет одних и тех же мутаций или разных? Какое-то представление об этом дает и эксперимент Ленски, но там параллельно эволюционируют только 12 популяций — маловато для надежной статистики.
Сотрудники факультета экологии и эволюционной биологии Калифорнийского университета в Ирвайне (США) заставили приспосабливаться к высокой температуре сразу 115 линий кишечной палочки (Tenaillon et al., 2012). Все подопытные популяции были выведены из одного клона, т. е. изначально имели одинаковый геном. Предки подопытных бактерий в течение 2 тыс. поколений жили в стандартной среде при оптимальной для них температуре 37 °C.
В ходе эксперимента микробам пришлось приспосабливаться к температуре 42,2 °C. Это максимум, при котором исходная популяция не погибает полностью. 115 подопытных линий жили при такой температуре в течение 2 тыс. поколений, после чего ученые взяли из каждой линии по одному микробу и отсеквенировали его геном.
Все линии неплохо приспособились к перегреву: скорость их размножения при высокой температуре к концу эксперимента была в среднем в 1,94 раза выше, чем у предкового штамма. Лучше всех приспособилась линия, в которой произошло угадайте что. Правильно, зафиксировался аллель-мутатор: вышел из строя ген mutL, участвующий в исправлении ошибок в ДНК. В этой линии закрепилось 73 мутации — гораздо больше, чем у всех остальных линий, поэтому ее пришлось исключить из сравнительного анализа.
В остальных 114 линиях произошло в среднем по 11 генетических изменений, в том числе 6,9 однонуклеотидной замены, 2,3 короткой вставки и делеции (выпадений нуклеотидов), 1,0 крупной делеции, 0,6 вставки мобильных генетических элементов и 0,2 крупной дупликации (удвоения участков ДНК).
Как мы помним, о доле полезных мутаций, поддержанных отбором, можно судить по соотношению значимых и синонимичных замен. У теплолюбивых кишечных палочек это соотношение сдвинулось в пользу значимых замен. Авторы рассчитали, что примерно 80 % значимых замен были полезными.
Но полезные приобретения оказалась весьма разнообразными у 114 линий. Каждая линия приобрела свой уникальный набор мутаций. Так, из 634 значимых однонуклеотидных замен лишь 157 (25 %) обнаружились более чем в одной линии подопытных бактерий. Большинство замен оказались уникальными, т. е. закрепились лишь у одной из 114 линий. При этом несколько замен явно пользовались повышенной «популярностью». Например, значимая мутация в кодоне 966 гена