Причины таких различий легко объяснить. РНК, синтезированная в одном или даже в нескольких десятках ядер, в течение первых часов раннего развития не может оказать существенное влияние и изменить синтез белка в огромных объемах цитоплазмы большого яйца. И только на стадии многих сотен или тысячи клеток, когда каждое ядро будет окружено небольшим участком цитоплазмы, синтез новых РНК сможет заметно повлиять на состав синтезируемых белков в данной клетке.
Определенную роль играет также и то, что на самых ранних стадиях развития (во время быстрых делений яйца) значительную часть клеточного цикла занимают репликация ДНК и митоз. Во время дробления яиц рыб и амфибий синтез ДНК происходит всего за 15 мин, но и весь клеточный цикл не превышает 30 мин. У дрозофилы же первые деления ядер происходят еще быстрее — каждые 9 мин. Это означает, что в каждый момент времени значительные участки ДНК заняты репликацией, что, вероятно, затрудняет транскрипцию.
Есть и другая, более важная причина, по которой синтез мРНК на самых ранних стадиях не может играть специфическую роль в развитии. Во время первых делений дробления малочисленные ядра еще не занимают в яйце окончательную позицию. Только после 10–15 митозов ядра будут распределены по яйцу и каждое из них будет окружено своим, отличающимся от других участком цитоплазмы, вместе с которым оно образует эмбриональную клетку, способную к дальнейшему развитию. Эти участки отличаются не только своим местоположением в яйце, они могут отличаться и по химическому составу, так как цитоплазма яиц у многих животных неоднородна.
Вот, например, как происходит раннее развитие у насекомых, и прежде всего у хорошо изученной дрозофилы. Первые семь-восемь делений ядер происходят в центре яйца без деления цитоплазмы, и в это время только ядра будущих половых клеток обособляются от остальных и перемещаются к заднему полюсу яйца. После того как после восьми делений число ядер достигнет 256, они, продолжая делиться, перемещаются из центра на периферию и распределяются в тонком слое цитоплазмы под яйцевой оболочкой. Там они образуют клетки, составляющие бластодерму. Только после этого темп делений замедляется, начинается синтез РНК и происходит детерминация — предопределение основных частей будущей личинки и мухи. Очевидно, что, пока ядра находились в общей для них цитоплазме в центре яйца, они ничем не отличались друг от друга и, следовательно, не могли синтезировать разные РНК. Только заняв различные места в яйце, попав в окружение своей цитоплазмы, они «узнали», какие именно гены в них должны работать. Иначе говоря, ядра получили от цитоплазмы, как сейчас говорят, «позиционную информацию». После этого они начинают синтезировать те виды мРНК, которые необходимы в их новой позиции.
Вместе с тем синтез белков в яйце достаточно интенсивен с самого начала развития: у одних видов он не прекращается со времени оогенеза, у других (например, у морского ежа) синтез белка сразу после оплодотворения возрастает в десятки раз. Для обеспечения этого процесса и происходит в оогенезе создание мощного белоксинтезирующего аппарата и накопление мРНК, часть из которых используется с самого начала развития, а часть вступает в действие наиболее поздних стадиях. Среди этих материнских мРНК, вероятно, отсутствуют те, которые специфически необходимы для таких процессов развития, как гаструляция или последующие этапы морфогенеза. Ведь в ходе этих событий разные клетки ведут себя по-разному, следовательно, они должны отличаться по некоторым белкам (и соответственно по мРНК). Вот тут уже, даже несколько раньше и необходима специфическая морфогенетическая функция ядер — разная в разных частях зародыша.
2. Как можно судить о начале работы генов
Начало работы генов, точнее, их экспрессию можно заметить по проявлению отцовских признаков, если эти признаки отличаются от материнских. Действительно, когда у зародыша появляются черты, присущие отцовскому организму, но отсутствующие у материнского, не остается сомнений, что отцовские гены начали работать (одновременно с ними обычно начинают работать и гены в хромосомах, полученных от матери). Трудность тут состоит в том, что обычно признаки, отличающие двух животных одного вида (например, окраска), проявляются только на поздних стадиях, когда мы и без того знаем, что гены давно уже начали работать.
Эту трудность можно частично преодолеть, если использовать межвидовые, межродовые и даже межсемейственные гибриды, у которых отличия родительских организмов были бы достаточно велики и могли бы проявляться на более ранних стадиях. Получение отдаленных гибридов хорошо удается у морских ежей, у рыб, хуже — у птиц и почему-то совсем плохо у амфибий. Во всех опытах, проведенных на гибридах, было показано, что их развитие начинается неотличимо от развития материнского организма. Этого и следовало ожидать: ведь на самых ранних стадиях гены, в том числе и отцовские, еще не работают. Отцовские признаки проявляются обычно позже — у более дифференцированных зародышей или даже только у ранней личинки.
Этот метод имеет тот очевидный недостаток, что эмбриональное развитие даже довольно далеких видов обычно протекает очень похоже и на ранних стадиях бывает трудно отыскать видовые или родовые различия. Кроме этого, при отдаленной гибридизации нет полной уверенности в том, что гены, находящиеся в различных (отцовских и материнских) хромосомах, будут включаться одновременно. Поэтому более надежные данные о начале функционирования генов были получены при изучении летальных гибридов.
При скрещивании далеких видов, даже если оплодотворение и произошло, дальнейшее развитие часто протекает ненормально и в результате заканчивается ранней или поздней гибелью. Такие гибриды называются летальными. При изучении многих летальных гибридов рыб и особенно амфибий было показано, что их развитие останавливается на одной и той же ранней стадии — поздней бластуле. Через определенное время гибридные зародыши, так и не преодолев эту стадию, погибают, очевидно, из-за каких-то несоответствий в работе отцовских генов в чужой им материнской цитоплазме. Важно, что, исследовав десятки гибридных комбинаций, никому не удалось обнаружить гибриды рыб или амфибий, у которых развитие останавливалось бы ранее поздней бластулы. На этой стадии гены рыб и амфибий определенно начинают работать. Ho выяснить в таких опытах, не произошла ли активация генов раньше, невозможно. Дело в том, что остановка развития — это типичное проявление морфогенетической функции ядер, т. е. экспрессия их генов. Очевидно, что их функционирование начинается несколько раньше остановки развития.
Рассмотрим в этой связи наши опыты с гибридами рыб. Если яйца вьюна оплодотворить спермиями рыб из других родов и семейств, но того же отряда карпообразных, то их развитие вначале идет нормально, но потом все более отклоняется от нормы. Тем не менее из таких гибридных зародышей выклевываются подвижные, хотя и уродливые личинки, которые погибают через несколько дней. Эти опыты ничего не могут сказать о том, когда происходит активация ядер зародыша, так как, раннее развитие таких гибридов внешне идет нормально и влияние отцовских генов обнаружить трудно. Однако эти эксперименты можно модифицировать. Если до оплодотворения яйца вьюна облучить высокой дозой рентгеновской радиации (10–20 тыс. рад), то их ядра будут разрушены, в то время как цитоплазма практически не пострадает. При оплодотворении таких яиц спермиями своего вида образуются андрогенетические (андрос — мужской) гаплоидные зародыши. Они содержат материнскую цитоплазму и отцовское гаплоидное ядро. Такие зародыши будут развиваться нормально, хотя все личинки в конце концов погибнут, так как гаплоиды нежизнеспособны.
Иной результат получается, если облученные, т. е. фактические безъядерные, яйца вьюна оплодотворить спермиями других видов рыб. При этом образуются андрогенетические гаплоидные гибриды, у которых цитоплазма яйца принадлежит вьюну, а гаплоидные ядра — другому, отцовскому виду. Мы использовали спермин золотой рыбки, барбуса, данио рерио и других аквариумных рыб. И во всех этих случаях развитие доходило только до стадии поздней бластулы, останавливалось и через некоторое время зародыши погибали. Это означает, что гены одного вида не способны обеспечить развитие в чужой цитоплазме. Однако время гибели разных гибридов оказалось неодинаковым: одни погибали почти сразу же после остановки развития, другие жили еще несколько часов. Для каждой гибридной комбинации было свое характерное время выживания. Так как цитоплазма у всех этих зародышей была одна и та же, то очевидно, что время их жизни зависело от активности чужеродных ядер.
Опыты показали, что чужеродные гены, оказавшись в цитоплазме вьюна, все же функционируют и начинают свою работу не позже стадии поздней бластулы.
Есть и более простой способ узнать о начале экспрессии генов зародыша. Если облучить яйцо рентгеновыми лучами уже после оплодотворения, то убиты будут оба ядра — и мужское и женское. Можно также оплодотворить облученное яйцо облученными спермиями. Результат был везде совершенно одинаков: развитие таких безъядерных зародышей всегда останавливалось на стадии поздней бластулы, перед самой гаструляцией.
Очевидно, что развитие безъядерного яйца может происходить только до той стадии, до какой оно было обеспечено запасом белков и мРНК, синтезированных в оогенезе. Остановка развития таких зародышей, по-видимому, наступит как раз тогда, когда возникает необходимость в новых белках, синтезированных на новых мРНК, транскрибированных не в оогенезе, а уже в собственных ядрах зародыша. Эти результаты не оставляют сомнений в том, что именно гаструляция является первым проявлением активности генов у рыб и амфибий.
Иные результаты были получены, однако, при инактивации ядер у других типов и классов животных. Кроме действия высоких доз радиации, инактивация генетического аппарата может быть эффективно достигнута действием специфических веществ, подавляющих транскрипцию, — актиномицина D или а-аманитина. Подавление транскрипции в яйцах морского ежа, вызванное этими веществами или радиацией, приводит к остановке развития на более ранних стадиях, чем у рыб и амфибий, — уже в