ВИЧ является, по сути дела, маленьким зеркальцем, в котором отражается кусочек жизни клетки. Сразу же после обнаружения ВИЧ и ВИО были начаты широкомасштабные исследования функциональных свойств вирусных генов и кодируемых ими продуктов, а также молекулярных механизмов взаимодействия между этими вирусами и клетками. Особое внимание было уделено влиянию вирусов иммунодефицита и отдельных их генов на клеточный метаболизм и зависимость репликации вирусов от молекулярных систем клеток-хозяев.
Bо второй половине 90-х гг. в результате комплексных исследований удалось обнаружить уникальную роль в развитии ВИЧ-инфекции особых рецепторов для специфических веществ — цитокинов. Оказалось, что для инфицирования клеток вирусом, выделенным непосредственно от больного, необходимо присутствие на поверхности С4-лимфоцитов не только CD4-коррецепторов, но и еще специальных дополнительных белков-корецепторов для хемокина, получивших название ССЫ-5 и СХСЫ-4. Только при наличии этих рецепторов и корецепторов в нормальном виде и количестве возможно заражение чувствительных клеток ВИЧ.
Изучение механизмов проникновения вируса в геном человека способствовало новому пониманию некоторых сложных молекулярных процессов, происходящих в клетках при различных мутациях, при репликации ДНК и при восстановлении ее целостности (репарации) в результате случайных поломок. Изучение многообразия ВИЧ, его чрезвычайной изменчивости, способности эволюционировать в каждом индивидуальном человеческом организме, по сути дела, создали новое представление о квазивидах (от латинского quasi — как будто, будто бы). Такого разнообразия раньше не наблюдали ни для одного организма в живой природе.
Широко разрекламированная полная расшифровка генома человека, завершившаяся в начале этого века, пока еще мало что дала для полного понимания функции многочисленных генов, содержащихся в нашем геноме. Мы сегодня еще не знаем даже точного числа генов, а из тех 35–40 тыс., которые предположительно имеются, нам известно в лучшем случае не более чем о 10–15 %. Над этим сейчас интенсивно работает армия ученых, использующая всевозможные сложные подходы и методы для решения этой весьма непростой задачи. И тут неожиданно «пришел» им на помощь ВИЧ. Вирус оказался идеальным объектом для нового направления в генетике — функциональной геномики. Для исследователей ВИЧ представляет собой, по сути дела, готовый эксперимент природы по максимальному мутагенезу при условии сохранения функции и репликативной способности живого объекта. Это уже было проиллюстрировано для обратной транскриптазы и протеазы ВИЧ-1, для которых известна кристаллическая структура и варианты, устойчивые к многочисленным лекарственным препаратам.
В ходе работ по исследованию реакции клетки на ВИЧ-инфекцию были обнаружены десятки ранее совершенно неизвестных ученым генов, установлены их функции. Так, в клетках были выявлены новые важные гены, участвующие в росте и размножении (пролиферации) клеток, в процессах запрограммированной клеточной гибели (апоптозе). Основываясь на способности одного из регуляторных белков ВИЧ по имени vpr вызывать апоптоз, сейчас пытаются использовать эти свойства вирусного белка для борьбы с раком.
Наконец, делаются попытки использовать вирус в качестве «контейнера», доставляющего гены в новые клетки, т. е. для целей нового направления в молекулярной медицине — генной терапии. Этому могут способствовать отдельные уникальные свойства ВИЧ. Дело в том, что главное условие успеха при генной терапии — обеспечение эффективного встраивания «лечебного» гена в геном клеток-мишеней и высокий уровень его работы там. При этом ген должен производить соответствующий лечебный белок только в определенных клетках и должен быть безопасным, в частности не быть канцерогенным, т. е. не приводить к возникновению рака. Многим этим условиям отвечают ретровирусы, способные переносить с собой другие гены. Чтобы ретровирусы были безопасны для человека, их слегка изменяют (убирают из них все вредное). Некоторые ретровирусы эффективны только для делящихся клеток, их невозможно применять для переноса генов, например, в клетки мышечной или нервной ткани, клетки печени и легких. Исключение составляют «переносчики» (векторы), создаваемые на основе лентивирусов. Будучи одним из лентивирусов, ВИЧ вполне подходит на роль такого хорошего вектора-переносчика генов не только в делящиеся, но и в неделящиеся клетки. Это уже продемонстрировано учеными на большом числе различных моделей: на клетках, которые размножаются в пробирке (т. е. in vitro), и на лабораторных животных, таких как мыши, крысы, кролики (т. е. in vivo). К сожалению, надо признать, что пока до реального применения таких векторов с целью лечения человека еще дистанция огромного размера. Констатация этого факта не останавливает ученых в своих поисках, и нет сомнения, что задача в конечном итоге будет успешно решена.
Беспрецедентные по масштабам и финансовым вложениям исследования ВИЧ, СПИДа и всего, что им сопутствует, позволяют считать, что сегодня появилось еще одно направление науки на стыке вирусологии, медицины и молекулярной генетики, которое иногда называют спидологией, хотя, может быть, его лучше назвать спидомикой, по аналогии с геномикой, протеомикой и другими новыми направлениями, возникшими за последние годы в молекулярной генетике в результате массовой расшифровки целых геномов и белков множества различных низших и высших организмов, включая человека.
ЧАСТЬ IIДИАГНОСТИКА И ЛЕЧЕНИЕ
Диагностика ВИЧ — разведка перед боем
Qui bene dignoscit — bene curat
Если болезнь не определена, невозможно и лечить ее.
Обнаружение вторгшегося в организм инфекционного агента, выяснение его природы — главная начальная стадия для успешного и эффективного лечения любой инфекционной болезни. Диагностика подобна разведке перед боем, без которой безрассудно и опасно вступать в сражение с противником. И чем точнее данные разведки, тем больше шансов на конечный успех сражения. В полной мере эти общие рассуждения относятся и к ВИЧ-инфекции.
Сегодня не существует такого единого теста, который бы позволял врачам ставить диагноз «СПИД», но уже создан целый ряд тестов для определения ВИЧ-инфекции. Стандартная диагностика, позволяющая обнаружить в организме наличие вируса, включает в себя обычно два этапа: установление собственно факта зараженности ВИЧ и определение стадии заболевания. За определением стадии неразрывно следует и выяснение характера течения заболевания, а затем и формирование прогноза у данного больного, а также выбор тактики и средств лечения теми средствами, которые на сегодняшний день имеются в распоряжении врачей.
Обнаружение ВИЧ-инфекции, так же как, впрочем, и любой другой вирусной инфекции, осуществляется с помощью специальных тестов на наличие одного или нескольких из четырех возможных компонентов вируса или белков крови: вирусной ДНК или РНК, вирусных белков (антигенов) или специфических антител к вирусным белкам, образующимся в организме. Все существующие тесты можно разделить на две группы: непрямые (определяющие наличие в организме человека не самого вируса, а антител к нему) и прямые (определяющие наличие в организме белков или нуклеиновых кислот, составляющих неотъемлемую часть вируса).
Мы не будем здесь пытаться глубоко проникнуть в обширнейшую область молекулярной генетики и иммунологии, а затронем лишь те моменты, которые касаются обнаружения биополимеров ВИЧ. B большинстве случаев для диагностирования инфекционного заболевания у пациента сначала берут кровь, а затем из нее выделяют сыворотку (жидкость крови без клеток), которую и используют для анализа. По этой причине последующие лабораторные реакции на наличие вирусной инфекции получили название серологических (от латинского слова serum — сыворотка). Серологические исследования ценны тем, что они помогают установлению диагноза в случае скрытого или хронического течения инфекции, когда клиническая картина смазана, расплывчата. Вот тут-то на помощь и приходят специфические антитела, антигены и гены, которые в таких случаях служат в качестве основной «улики», позволяющей установить истинное лицо проникшего в организм микроорганизма-возбудителя.
Немного истории
И. П. Павлов писал: «Медицинская деятельность — ровесница первого человека». Изначала было ясно, что нельзя лечить неизвестную болезнь. Поэтому еще в глубокой древности лекари уделяли большое внимание диагностике заболеваний. Особо отличались в этом отношении медицинские школы в Вавилоне и Ассирии. Длившийся много веков начальный период становления медицины целиком зависел от органов чувств лекаря. На их основе главным образом и ставился диагноз.
Из наблюдений и опыта тысячелетий, передававшихся из поколения в поколения людей, постепенно рождалось рациональное врачевание. Тот факт, что какие-либо случайно примененные средства или приемы приносили пользу страждущему, устраняя боль, останавливая кровотечение, облегчая состояние путем вызывания рвоты и т. п., позволял в дальнейшем прибегать к их помощи, если возникали похожие обстоятельства. Главным тогда при определении заболевания было наблюдать за патологическими проявлениями и сравнивать их с физиологическими, соотнося при этом определенное патологическое состояние пациента с ранее известными сходными патологическими состояниями. Так, уже 4 тыс. лет назад при определении болезней китайские медики придавали огромное значение исследованию пульса, различая более 500 его видов при разных патологиях. Около I тыс. до н. э. в зените расцвета медицина находилась в Древней Индии. Существовавшие тогда медицинские знания нашли свое отражение в почитаемом до сих пор на Востоке «Астрологическом календаре животных», имеющем огромное значение при диагностике заболеваний и определении индивидуальных особенностей пациентов. Главным принципом индо-тибетской медицины стало положение о единстве и целостности человеческого организма.
Продолжая традиции вавилонских, египетских и индийских врачей, основоположник современной медицины Гиппократ в V в. до н. э. развил учение о признаках болезней и диагностике. Он положил начало искусству тщательного клинического наблюдения как обязательного основания для постановки диагноза болезни. Гиппократ причислял себя к потомкам греческого бога врачевания Асклепия (в римской мифологии — Эскулап). (В античном искусстве неотъемлемым атрибутом Асклепия была змея, олицетворяющая собой мудрость, обновление и могущество сил природы. Изображение посоха, обвитого змеей, и чаши со змеей стали впоследствии основными эмблемами медицины.) Гиппократ первым поставил медицину на научные основы, выведя ее из темного мира эмпиризма.
Появление инструментальных и лабораторных методов диагностики ознаменовало наступление нового этапа в развитии медицины. Считается, что химический, а также физический анализы в практику медицины ввел знаменитый Парацельс. Дополнительная информация, недоступная ранее простому восприятию через обычные органы чувств, существенно изменила возможности точной диагностики заболеваний. Одними из наиболее значительных событий этого периода можно считать создание микроскопа и открытие рентгеновских лучей в конце XIX в.
В плане развития диагностики микробных заболеваний показательна история появления теста на туберкулез. В конце XIX в. малоизвестный тогда немецкий врач Роберт Кох много лет наблюдал за больными чахоткой. Для того чтобы обнаружить наличие у больных возбудителя заболевания, он перепробовал большое число разных красителей. И в конечном итоге чисто эмпирически подобрал и краситель, и температуру, при которой он работает. Так был создан знаменитый препарат № 271, который совершил переворот в медицине: на коричневом фоне тканей стали легко различаться «прекрасно голубые» микроорганизмы — микобактерии туберкулеза, которые современники позднее назвали «палочкой Коха», а сам Р. Кох в 1905 г. получил за это открытие Нобелевскую премию по физиологии и медицине. Кох также сформулировал действующие до сих пор критерии для определения взаимосвязи между конкретным микроорганизмом и инфекционным заболеванием, получившими название «постулаты Коха» или «триада Коха»: 1) микроорганизм должен обнаруживаться во всех случаях данной болезни, но не должен встречаться у здоровых людей или при других болезнях; 2) микроорганизм должен быть выделен из организма больного человека в чистой культуре; 3) введение чистой культуры микроорганизма в чувствительный организм должно вызвать данную болезнь.
Существенный прогресс в диагностике инфекционных заболеваний, вызываемых нашими невидимыми врагами — микробами, связан с появлением иммунологических методов анализа, создание которых стало возможным после открытия антител. Классические методы иммунохимического анализа, описанные еще в конце XIX в., основаны на образовании антителами в присутствии антигена преципитата (осадка), который появляется в результате формирования высокоспецифических комплексов «антиген-антитело». Наиболее известное достижение в начале XX в. — создание Августом фон Вассерманом в 1906 г. диагностики на сифилис, получившей в дальнейшем название реакции Вассермана, — остается до сих пор самым распространенным тестом в венерологии. Постепенно иммунологические методы совершенствовались, упрощались и в конечном итоге получили широкое распространение в медицинской практике. Детектирование образовавшегося комплекса «антиген-антитело» в растворе стали осуществлять, добавляя в один из исходных компонентов реакционной системы ту или иную «метку», по которой можно следить за ходом реакции. Весьма удобными для этой цели оказались изотопные (радиоактивные), ферментные, флуоресцентные, парамагнитные и другие метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность иммунохимических методов в миллионы раз, а время анализа уменьшить до нескольких часов.
Нынешний период диагностики характеризуется созданием новых сверхчувствительных методов, расширением их арсенала и внедрением разнообразного медицинского оборудования и компьютерных технологий. Современные иммунохимические методы, основанные на применении «меченых» компонентов, нашли широкое распространение для количественного определения в крови больного биологически активных соединений самой разнообразной структуры — от низкомолекулярных гормонов, онкомаркеров и лекарственных препаратов до высокомолекулярных вирусов, бактерий и даже целых клеток. Основным методом обнаружения антител стал иммуноферментный анализ (сокращенно — ИФА). Этот метод был предложен в начале 70-х гг. прошлого столетия тремя независимыми группами исследователей, работавших в Швеции, Нидерландах и США. Сегодня он стал наиболее часто используемым иммунологическим методом в любых медицинских учреждениях благодаря своей невысокой стоимости и экологической безопасности.
Широкое распространение в последние годы получил революционизирующий метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который по своей чувствительности намного превышает другие современные методы анализа генетического материала.
Первоначально, до того как был открыт ВИЧ, диагноз СПИДа ставили только на основании общей клинической картины. Обнаружение возбудителя заболевания в 1983 г. привело к быстрому развитию специальных методов лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции. Уже в начале 1985 г. в США была введена обязательная проверка доноров крови на антитела к ВИЧ. А вскоре (в начале 1987 г.) первый анализ на ВИЧ был осуществлен и в России.
Рассмотрим теперь подробнее основные приемы и методы, которые сегодня применяются в практической медицине для установления наличия или отсутствия ВИЧ-инфекции. Обычно для этих целей используют уже готовые диагностические наборы (тест-системы), производимые разными фирмами, которые прошли предварительно очень строгие испытания и получили государственное одобрение на их применение в клинике.
ИФА — не прямой, но точный метод
К числу наиболее апробированных и усовершенствованных непрямых методов диагностики ВИЧ-инфекции относится метод, позволяющий обнаруживать в организме не сам ВИЧ, а антитела к его антигенам, которые появляются в крови у ВИЧ-инфицированных пациентов. Иммунная система организма почти сразу реагирует на присутствие чужеродного врага, выпуская против него снаряды-антитела. Вот их-то и пытаются в первую очередь обнаружить медики, используя для этой цели специальные диагностикумы (тест-системы), основанные на так называемом иммуноферментном анализе (сокращенно ИФА). Из названия следует, что в этом анализе используется два типа реакций: иммунологическая и ферментативная.
В настоящее время существует множество вариаций ИФА. Но все они основаны на одной и той же давно уже установленной способности антител специфически взаимодействовать только с «собственными» антигенами, т. е. на иммунологической реакции «антиген-антитело». Наибольшее распространение получил гетерогенный вариант иммуноферментного анализа, при котором антиген (определяемое соединение) или антитела фиксируются на твердой основе, в качестве которой могут выступать полистироловый планшет, полистироловые бусины, пористая подложка или магнитный носитель. Как правило, анализ проводят в три стадии. Схематически эти процедуры изображены на рис. 26. B лунку планшета, содержащую на своих стенках тот или иной антиген (т. е. один из белков вируса), добавляют исследуемый биологический материал, который чаще всего представляет собой сыворотку крови больного. При наличии в организме инфекционного агента в сыворотке появляются антитела к нему (на рисунке обведены). Они прочно связываются с антигеном и не удаляются при последующей промывке чашки. Это первая и основная стадия ИФА. На рисунке антитела изображены в форме «рогатки». И это неслучайно. Как уже указывалось ранее (рис. 2), антитела в действительности устроены как рогатка, из которой мальчишки-хулиганы стреляют куда попало. Только в отличие от рогатки ребячьей антитела строго специфично «стреляют» по мишеням — антигенам, которые их «породили».
Рис. 26. Для проведения ИФА необходимо осуществить несколько операций. (А) На первом этапе к антигену, сорбированному на твердой поверхности (1), добавляют сыворотку крови, содержащую антитело (2). Затем в лунку вносят неспецифические антитела, слитые с ферментом (такой комплекс называют коньюгатом) (3). На конечном этапе (4) в ту же лунку вносят способное окрашиваться вещество — хромоген. Если образуется комплекс-«пирог» (Б), то хромоген под действием фермента расщепляется и появляется окраска. Это означает, что все элементы цепочки присутствуют, «пирог» испекся, и результат тестирования антител положительный
На следующем этапе необходимо определить, образовался или нет в лунке иммунный комплекс, т. е. произошло ли соединение антигена с антителом или не произошло. Невооруженным глазом и даже под микроскопом этого нельзя увидеть. Собственно, для этого и требуются следующие две стадии, которые можно назвать проявляющими. На второй стадии анализа в лунку вносят специальные (реагирующие с разными антителами) антитела с заранее прикрепленным к ним определенный ферментом (отсюда и появляется слово «ферментный» в названии метода ИФА). Слитый в едино комплекс «антитело-фермент» (его называют конъюгатом) способен в свою очередь связаться с антителами человека, уже зацепившимися за антиген, который изначально закреплен на твердой подложке. B результате возникает «молекулярная цепочка», на одном конце которой вирусный белок, а на другом — фермент. После отмывки весь этот многослойный «пирог» остается в лунке планшета. Теперь нужно только обнаружить активность фермента, чтобы сделать вывод о наличии антитела. Для этого на третьей стадии в ту же лунку вносят раствор субстрата и специального бесцветного вещества — хромогена, который способен окрашиваться в результате серии биохимических реакций, осуществляемых присутствующим в лунке ферментом. Если в лунке появляется окраска, это означает, что все элементы цепочки присутствуют, «пирог» испекся.
Из этого следует вывод: в крови пациента имеются антитела к антигенам ВИЧ, и, следовательно, сам пациент инфицирован этим вирусом. Существуют и другие варианты метода ИФА. Например, можно детектировать не антитела, а сам антиген. Процедура в целом будет похожей, хотя немного более сложной.
Так как ВИЧ-инфекция в большинстве случаев длится пожизненно, то для диагностики достаточно самого факта обнаружения антител на любом этапе развития заболевания. Медики считают, что обнаружение антител с помощью ИФА является очень чувствительным методом, который выявляет свыше 99 % инфицированных ВИЧ лиц.
Достоверность результатов, получаемых с помощью ИФА, в некоторой мере зависит как от особенностей самого организма, так и от качества используемого медиками диагностического набора. Дело в том, что ИФА, подобно любому другому методу, изредка может дать так называемые ложноположительные или ложноотрицательные результаты, т. е. ввести в заблуждение. Nihil est omni parte beatum (ничто не совершенно). B первом случае анализ на ВИЧ показывает положительный результат, хотя вируса у человека совсем и нет. Ситуация довольно редкая, но она имеет место, и специалисты это прекрасно знают. С чем это может быть связано? Выяснилось, что подобная ложная реакция может иногда иметь место у пациентов с другими хроническими инфекциями или раковыми заболеваниями. Причиной ложно-положительных результатов при постановках ИФА может стать наличие у пациентов аутоиммунных процессов, антител к ревматоидному фактору, вирусу Эпштейн-Барр, некоторым молекулам, участвующим в нормальной работе иммунной системы. Частота ложноположительных результатов зависит и от качества используемой тест-системы. Так, для разных диагностических наборов (а их сейчас имеется большое количество) она колеблется от 0,02 до 0,5 %. Число ошибочных результатов значительно снижается при использовании в качестве антигена не белков, выделенных из вируса, а так называемых рекомбинантных белков ВИЧ, т. е. вирусных белков, синтезированных in vitro с помощью методов генной инженерии.
На практике более опасна другая ситуация — ложноотрицательная реакция при ИФА, которая изредка (в 1–5 %) встречается при обследовании пациентов (анализ показывает, что вируса нет, а на самом деле он присутствует и делает уже свое черное дело). Вполне естественно, что успокоенный благоприятным результатом, но на самом деле ВИЧ-инфицированный, человек не принимает никаких мер по борьбе с собственной инфекцией. B результате заболевание развивается без лечения, а человек становится источником новых заражений. Ложноотрицательная реакция при ИФА связана с несколькими причинами. Во-первых, хорошо известно, что антитела к вирусу иммунодефицита человека вырабатываются не мгновенно после его проникновения в организм человека. Период, когда вирус уже присутствует в крови, а антитела еще не появились, называется «серологическим окном». B период «окна», несмотря на высокое содержание ВИЧ в крови, тест будет отрицательный, т. е. ложноотрицательный. Но в данный период инфицированный человек уже может передавать вирус другим людям. Обычно заметное количество антител к ВИЧ появляется в крови через две-десять недель после заражения. Однако применительно к каждому человеку разброс во времени может быть весьма велик. Так, у 90–95 % зараженных они обнаруживаются в течение трех месяцев после заражения, у 5–9 % — через шесть месяцев от момента заражения, а у 0,5–1 % — даже в более поздние сроки. Наиболее ранний срок обнаружения антител — две недели от момента заражения. Поэтому при наличии данных, свидетельствующих о контакте пациента с инфицированными ВИЧ, обычно проводят повторные исследования через два-три месяца. Так обстоит дело у взрослых.
Еще сложнее ситуация у новорожденных детей. Как у зараженных, так и у незараженных детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, в первые 6—12 месяцев жизни практически всегда обнаруживаются антитела к ВИЧ. Но они имеют материнское происхождение и затем могут или сохраниться, или исчезнуть. Только по прошествии 18 и более месяцев обнаружение антител к ВИЧ служит для врачей важнейшим критерием, свидетельствующим о наличии у ребенка ВИЧ-инфекции. Отсутствие антител к ВИЧ у ребенка в возрасте 18 месяцев, рожденного от инфицированной ВИЧ матери, считается сегодня однозначным указанием против наличия у него вируса.
Итак, ложноотрицательная реакция при ИФА может получаться тогда, когда анализ производят на самой начальной стадии инфекции. Такая же реакция возможна и на конечных этапах развития болезни, когда иммунитет пациента ослаблен настолько, что антитела к ВИЧ практически перестают вырабатываться.
Несмотря на определенные ограничения, ИФА был и остается основным методом, который используется сегодня для обнаружения ВИЧ-инфекции в многочисленных диагностических лабораториях и центрах как в России, так и за рубежом. Для этой цели используют разнообразные диагностические наборы, которые производятся и у нас в стране, и в других странах мира. Причем специалисты считают, что даже лучшие зарубежные диагностикумы ничем не превосходят по чувствительности и надежности российские аналоги, а по цене они существенно им уступают.
Иммуноблоттинг — дополнительный непрямой метод
Кроме ИФА в определенных случаях для тестирования ВИЧ-инфекции используют процедуру, называемую «иммуноблоттинг» или «иммунный блоттинг» (иногда называют еще «вестерн-блот»). По рекомендации ВОЗ иммуноблотинг используется при диагностике ВИЧ-инфекции в качестве дополнительного экспертного метода, который должен подтверждать результаты ИФА. Обычно этим методом перепроверяют положительный результат при ИФА, поскольку он считается более чувствительным и специфичным, хотя более сложным и дорогим. Но прежде чем подписать окончательный приговор пациенту, врач должен убедиться полностью в правильности диагноза. Поэтому вопрос о сложности и дороговизне здесь не может быть решающим.
Как по назначению, так и по способу исполнения к иммунному блоттингу хорошо подходит известное выражение «вывести на промокашку». Иммунный блоттинг сочетает в себе иммуноферментный анализ (ИФА) с предварительным электрофоретическим разделением белков вируса в геле и их переносом на нитроцеллюлозную мембрану («промокашку»). Процедура иммуноблота состоит из нескольких стадий (рис. 27). Сначала предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов ВИЧ подвергается электрофорезу, при этом все входящие в состав вируса антигены разделяются по молекулярному весу. Затем методом блоттинга (аналог выдавливания на «промокашку» избытка чернил) антигены переносят из геля на полоску нитроцеллюлозы или нейлонового фильтра, которые отныне содержат невидимый пока глазом спектр белков, характерный для ВИЧ. Далее на стрип наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т. п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются со строго соответствующими им полосками белков-антигенов. В результате последующих манипуляций (подобных ИФА) результат этого взаимодействия визуализируется — делается видимым. В конечном итоге наличие полос на определенных участках стрипа подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определенным антигенам ВИЧ.
Иммунный блоттинг чаще всего используют для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции. ВОЗ считает положительными сыворотки, в которых методом иммунного блотинга обнаруживаются антитела к каким-либо двум белкам оболочки ВИЧ. Согласно этим рекомендациям, при наличии реакции только с одним из белков оболочки (gp160, gp120, gp41) в сочетании или без реакции с другими белками результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование с использованием набора другой серии или другой фирмы. Для подстраховки, если
Рис. 27. Для проведения иммуноблотинга на первом этапе белки, содержащиеся в сыворотке крови, разделяют в геле по их молекулярной массе и заряду с помощью электрического поля (методом электрофореза в геле). Затем на гель накладывают нитроцеллюлозную или нейлоновую мембрану и «промокают» (это и есть блоттинг). Это осуществляют в специальной камере, которая позволяет осуществить полный пернос материала из геля на мембрану. B результате та картина расположения белков, которая была на геле, воспроизводится на мембране (блот), с которой можно далее легко манипулировать. Первоначально мембрану обрабатывают антителами к искомому антигену, а после отмывки несвязанного материала добавляют радиоактивно меченный коньюгат, который специфически связывается с антителами (как в ИФА). Местоположение образующегося комплекса «антиген-антитело — меченый коньюгат» определяют с помощью авторадиографии с использованием рентгеновской пленки. После ее проявления становится ясным, есть ли антигены в крови или их нет и после этого результат остается сомнительным, рекомендуется последующее наблюдение в течение шести месяцев (исследования продолжаются через каждые три месяца).
B настоящее время в РФ для использования при диагностике ВИЧ-инфекции рекомендовано использовать пять тест-систем, среди которых имеются как российские, так и зарубежные.
ПЦР — высокочувствительный прямой метод
Аббревиатура ПЦР расшифровывается «полимеразная цепная реакция». За создание этого потрясшего мир метода ее первооткрывателю Керри Мюллису в 1993 г. была присуждена Нобелевская премия. Все гениальное — просто. Это можно сказать и о ПЦР. За свою чувствительность, изящность и точность новый метод с быстротой молнии распространился по всему миру. B настоящее время ПЦР используется для проведения научных и практических исследований, но прежде всего этот метод нашел широкое применение в области вирусной и микробиологической диагностики. ПЦР позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой участок генетической информации (несколько десятков — несколько сотен пар нуклеотидов ДНК или РНК) любого организма, содержащийся в следовых количествах среди огромного количества нуклеотидных последовательностей иной природы, и быстро многократно размножить его.
ПЦР имеет мало общего с хорошо всем известной ядерной цепной реакцией, происходящей при делении атомных ядер под действием нейтронов. Общность заключается только в том, что в обоих случаях реакция цепная, т. е. очень сложная, усиливающаяся в геометрической прогрессии. По сути дела, метод ПЦР имитирует в пробирке естественную репликацию ДНК, только повторяющуюся с огромной скоростью и столько раз, сколько это необходимо исследователю. Метод включает несколько этапов: расплетание двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и последующее комплементарное дополнение (достройку) обеих с помощью специального фермента. Репликация ДНК может начаться не в любой точке, а только в определенных стартовых блоках — коротких двунитевых участках. Для того чтобы осуществить такой процесс в пробирке, используют две генетические пробы (праймеры), которые и служат в качестве затравки для синтеза второй цепи на однонитевой ДНК. Праймеры — это искусственно синтезированные короткие нуклеотидные последовательности (15–30 нуклеотидов), комплементарные концам размножаемых (амплифицируемых) участков нитей ДНК. Понятно, что, чтобы иметь нужные праймеры, необходимо знать нуклеотидную последовательность того участка ДНК, который требуется размножить. Суть метода ПЦР отображена на рис. 28 .
Рис. 28. Метод ПЦР весьма чувствительный, его проведение требует большой предосторожности. Необходимые пояснения см. на рисунке и в тексте.
Сначала двунитевую ДНК нагревают до температуры около 100о С. При этом комплементарные нити ДНК расходятся между собой (ученые говорят — ДНК денатурирует). Затем к обеим нитям ДНК по принципу комплементарности присоединяют искусственно синтезированные праймеры, в результате чего образуются короткие двунитевые «стартовые» участки. Далее в действие вступает специфический бактериальный фермент — Taq-полимераза. Кроме способности синтезировать ДНК эта полимераза обладает еще одной важной особенностью: она устойчива к высоким температурам, при которых другие белки теряют свои свойства. Термоустойчивая полимераза осуществляет in vitro (т. е. в пробирке) синтез вторых цепей ДНК на каждой из двух денатурированных цепей. После нового прогрева до 100о С уже вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации — это и есть цепная реакция ПЦР. В результате такого «тиражирования» в пробирке уникальных участков генов вируса или бактерий за два-три часа количество копий фрагмента ДНК увеличивается в геометрической прогрессии, и через 25 циклов амплификации синтезируется 106 копий фрагмента. Такое количество ДНК уже достаточно, чтобы визуально ее регистрировать с помощью простых приемов, которые уже давно используются молекулярными биологами.
С момента возникновения метод ПЦР постоянно совершенствовался, и в настоящее время он позволяет выявлять в биологических объектах даже единичные вирусные частицы или бактерии. Чувствительность амплификационных тест-систем составляет от 1 до 100 вирусов, в то время как чувствительность иммунологических (не говоря уж о микроскопических) тестов на два-четыре порядка ниже. Кроме того, ПЦР имеет высокую специфичность, которая обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного вида возбудителя, фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров и специально отрабатываемыми жесткими условиями их присоединения к матрице при проведении реакции. Соответственно, амплификационные тест-системы, в отличие от иммунологических тест-систем, позволяют избежать проблем, связанных с перекрестно реагирующими антигенами. И наконец, привлекательна быстрота получения результата при использовании ПЦР. За счет автоматизации определение возбудителя осуществляется обычно в течение одного рабочего дня. Правда, очень высокая чувствительность метода имеет и обратную сторону медали: реакция может происходить и при наличии незначительных примесей, случайно попавших в рабочие растворы, на инструменты и даже на хорошо вымытую посуду. От исследователей требуется сверхтщательное отношение к постановке эксперимента, особая культура в технологии проведения подобного рода анализа. Даже наличие одной молекулы вируса, случайно внесенной в реакцию извне (порой даже из воздуха), может дать положительный сигнал, хотя на самом деле в анализируемой крови вирус отсутствует (такой сигнал, как уже говорилось, называется ложноположительным).
ПЦР — метод, позволяющий оценивать наличие в крови как самого вируса, так и провируса (РНК или ДНК). Известная фирма «Ля Рош» активно разрабатывает и продвигает диагностические тест-системы, основанные на технологии ПЦР. Уже в 1994 г. эта компания выпустила первую коммерческую тест-систему под названием «AMPLICOR HIV-1 Monitor», с помощью которой можно было довольно точно и надежно измерить количество РНК ВИЧ-1 («вирусную нагрузку») в крови. Эта система и сегодня является единственной разрешенной Управлением по контролю качества продуктов и лекарств США (FDA) для измерения вирусной нагрузки. Чувствительность теста очень высока, когда речь идет о количестве определяемого материала. Он позволяет выявить наличие всего 50 копий вирусной РНК в 1 мл крови, что значительно чувствительней, чем у других диагностических тест-систем.
Диагностическая чувствительность оценивается в процентах и определяет долю пациентов с данным заболеванием, дающих истинно положительные результаты при использовании конкретного набора. Например, для французских наборов «Ампликор» диагностическая чувствительность составляет от 95 до 100 %. Российские фирмы-производители выпускают диагностикумы, сходные по этому показателю.
На сегодняшний день ПЦР-наборы для диагностики ВИЧ-инфекции не достигают диагностической чувствительности более 98 %, т. е. выявляют ВИЧ в среднем лишь у 98 из 100 ВИЧ-инфицированных людей, в то время как современные тест-системы, основанные на ИФА, имеют порой чувствительность, равную 99 % и даже более. Разница вроде бы и небольшая, но за ней стоят многочисленные человеческие судьбы. Каждая доля процента — это тысячи людей, у которых или вовремя не обнаружили ВИЧ, и это помешало начать экстренную медицинскую помощь, или наоборот — смертельно напуганных без всякой на то причины. Основная причина меньшей диагностической чувствительности ПЦР при высокой чувствительности самого метода — сильная вариабельность генома ВИЧ, на который она направлена.
Все приведенные оговорки никак не снижают важность метода ПЦР. Особую ценность для диагностики ВИЧ-инфекции ПЦР имеет на двух этапах: в самом начале, когда инфицирование уже произошло, а антитела еще не успели образоваться, и на поздних стадиях заболевания, когда количество антител может снижаться вплоть до полного исчезновения. Количественное определение РНК ВИЧ позволяет устанавливать уровень виремии («вирусную нагрузку»). С помощью ПЦР врачам очень удобно оперативно оценивать, как отражается на пациенте тот или иной вариант противовирусной терапии, который был применен в ходе его лечения.
Без антигенов и антител
Приведенные выше данные говорят об отсутствии единого «теста на СПИД». Это определяет в некоторых случаях необходимость использования и иных подходов. После обнаружения ВИЧ врачи обычно используют другие дополнительные тесты, в частности такие, как тест на пневмоцистную пневмонию (разновидность воспаления легких) и онкологию. Имеющий огромный опыт работы по диагностированию ВИЧ у населения академик B. B. Покровский пишет, что «диагностика любого инфекционного заболевания основана на сопоставлении эпидемиологических, клинических и лабораторных данных, и преувеличение значения одной из групп этих данных может привести к диагностическим ошибкам». Он отмечает также типичную ошибку, которая встречается при диагностике ВИЧ-инфекции: часто диагноз устанавливается на основании какого-нибудь одного лабораторного теста, к которому у врача по той или иной причине имеется чересчур сильное доверие. Иногда отдельные сотрудники лабораторий даже сами берут на себя смелость устанавливать диагноз ВИЧ-инфекции, никогда не видя самого больного, а только проанализировав присланную им кровь. А некоторые клиницисты безоговорочно доверяют результатам лабораторных исследований, которые могут служить только как отдельные свидетели в деле вынесения «окончательного приговора». Таким образом, постановка диагноза — дело очень тонкое и ответственное.
Ряд клинических состояний позволяет врачам диагностировать СПИД без лабораторного подтверждения ВИЧ-инфекции, если оно не проводилось или дало неопределенные результаты. B целях клинической диагностики ВОЗ предложила проводить балловую оценку симптомов, имеющихся у подозреваемого на ВИЧ-инфекцию больного. Все эти заболевания считаются косвенными признаками СПИДа:
Персистирующая генерализованная лимфаденопатия (увеличение лимфоузлов — не менее 1 см в диаметре — в двух или более несоприкасающихся внепаховых локусах) — О
Изменения на коже и слизистых оболочках — 1
Снижение массы тела — 1
Выраженная утомляемость — 1
Простой герпес — 2
Диарея продолжительностью свыше 1 мес. — 4 Лихорадка продолжительностью свыше 1 мес. — 4 Снижение массы тела свыше 10 % — 4 Туберкулез легких — 5
Рецидивирующая бактериальная инфекция — 5
Лейкоплакия полости рта (повышенное ороговение эпителия слизистой оболочки) — 5
Стоматит, молочница рта — 5
Локализованная саркома Капоши — 8
Кахексия (крайняя степень исхудания) — 12
При сумме баллов от 0 до 3 вероятность ВИЧ-инфекции очень мала, 4—11 баллов — заболевание вероятно, а 12 и выше — очень вероятно.