Многие клетки старых тканей находятся в состоянии различной степени дегенерации: вакуолизации, нейрофагии, гиалиновой дегенерации, гидропического набухания, вакуолизации и сморщивания, частичного растворения клеток с возрастом.
Наружная клеточная мембрана клеток также значимо изменяется: отмечаются очаговые уплотнения и утолщения, снижается интенсивность микропиноцитоза, количество микроворсинок, микровыростов. Изменяется количество и функция щелевидных контактов клеток и соединяющего клетки межклеточного вещества.
Качественно меняется реакция клетки на внешние возбудители прежде всего за счет значительного изменения числа рецепторов на ее поверхности.
В нервной ткани развивается простая и пигментная атрофия ганглиозных клеток, липофусциновая блокада пирамидальных клеток, хроматолиз двигательных нейронов и клеток Пуркинье, а также пирамидных клеток коры мозга.
Роль лизосом в старении клеток
Лизосомы – совершенно необходимый компонент клетки, участвующий в ее питании и обновлении. Один из признаков лизосом – наличие в них ряда ферментов (кислых гидролаз, всего их около 40), способных расщеплять белки, углеводы, липиды и нуклеиновые кислоты. К числу ферментов лизосом относятся катепсины (тканевые протеазы), кислая рибонуклеаза, фосфолипаза и др. Кроме того, в лизосомах присутствуют ферменты, которые способны отщеплять от органических молекул сульфатные (cульфатазы) или фосфатные (кислая фосфатаза) группы.
Для лизосом характерна кислая реакция внутренней среды. Обычно рН в лизосомах составляет около 4,5–5 (концентрация протонов на два порядка выше, чем в цитоплазме). Это обеспечивается активным транспортом протонов, который осуществляет встроенный в мембраны лизосом белок-насос – протонная АТФаза; в старости рН повышается до 6,0.
Высокая активность кислой фосфатазы ранее использовалась как один из маркеров лизосом. В настоящее время более надежным маркером считается присутствие специфических мембранных гликопротеидов – LAMP1 и LAMP2. Они присутствуют на мембране лизосом и поздних эндосом, но отсутствуют на мембранах других компартментов клетки.
Достаточно постоянным признаком старения клетки является повышение количества первичных лизосом, в них увеличивается количество недопереваренных субстанций, липофусцина, снижается стабильность лизосомальных мембран. Липофусцин формируется в лизосомах из продуктов пероксидации липидов, ионов железа и перекрестно сшитых белковых агрегатов. Типичным считают повышение проницаемости мембран лизосом и аутолиз клеток.
Старые клетки часто характеризуют по экспрессии β-галактозидазы, активной при рН = 6, лизосомальная гидролаза в норме активна при рН = 4. В качестве теста биологического возраста, видимо, может служить кислая фосфатаза печени, положительно коррелирующая с возрастом у мышей, а также отношение МДГ/ЛДГ в печени и почках мышей и крыс.
Апоптоз клеток
Накопление в тканях с возрастом старых клеток, возможно, является результатом появления резистентных к апоптозу стареющих клеток, которые аккумулируют множественные повреждения, приводящие в конечном счете к неоплазии, нейродегенеративным процессам и инфаркту миокарда. Как считают, это связано с развитием в старости репрессии генов G1-фазы, увеличением экспрессии гена анти-апоптоза bcl2 и отсутствием протеолиза, что является «тройным замком», предотвращающим апоптотическую гибель стареющих фибробластов, как считает ряд авторов.
Апоптоз представляет собой запрограммированную гибель клетки и носит активный специфический характер, отличающийся от пассивного процесса некроза тканей: зависит от синтеза ДНК и РНК, ионов кальция и активных форм кислорода (АФК), сопровождается пикнозом ядра и фрагментацией ДНК специфическими ферментами, для него характерна ранняя потеря потенциала мембран митохондрий и появление фосфатидилсерина на мембране клеток, что индуцирует их активный фагоцитоз, а также отсутствие рубца на месте апоптоза. Этот набор признаков может различаться в зависимости от конкретного механизма апоптоза.
Апоптоз может происходить как запрограммированно (обычно на различных этапах эмбриогенеза), так и индуцироваться Fas-рецепторами мембраны, фактором некроза опухоли, внешними АФК и внутренним повышением Н2О2, повышающими цАМФ клетки факторами, активацией аденозиновых рецепторов, повышением кальция цитоплазмы (иономицином – А23187) и любым длительным повышением кальция цитоплазмы, что ведет к деэнергизации митохондрий.
Цитохром С-зависимый путь апоптоза является, видимо, отдельным путем как реакцией на появление митохондриального цитохрома C в цитоплазме клеток; набухание митохондрий приводит к открытию митохондриальной поры с выходом индуцирующего апоптоз белка.
Любое повышение фосфатидилсерина на клетке ведет к ее фагоцитозу. Повреждения ДНК в ходе мутагенеза, ионизирующего облучения, стресса, возможно, и в ходе старения также могут запускать апоптоз.
Главный путь проапоптических эффектов – белок р53, он осуществляет динамический баланс (с участием белка р26 и др.) основных механизмов повреждения и репарации клетки: повреждение ДНК – репарация ДНК – запуск апоптоза. Белок Bcl2 (баланс bcl2/bax), видимо, главный антиапоптический путь: этот белок входит в структуры ядра, митохондрий, саркоплазматического ретикулума, снижает выход ионов кальция из последнего, а также осуществляет иные не совсем ясные по механизму антиапоптические эффекты.
Снижение самообновления (деления) клеток в старости
Пролиферативная активность большинства клеточных популяций в организме снижается с возрастом, что проявляется в снижении митотического индекса, скорости синтеза ДНК, снижении ответа на пролиферативные стимулы (снижение потенциала клеточного роста), удлинении клеточного цикла и увеличении времени самообновления тканей. Так, пролиферативная активность клеток кожи 70-летних людей в 10 раз ниже, чем 20-летних, снижается также минимум в 2 раза количество стволовых клеток в коже.
Резкое снижение с возрастом факторов роста в крови указывает на то, что снижение клеточного роста с возрастом – регуляторный феномен.
Выявление факторов роста тканей и активаторов Т-лимфоцитов – регуляторов роста соматических тканей – представляется наиболее важным направлением профилактики старения и биоактивации практически в любом возрасте.
Соматические клетки высших эукариот, как правило, имеют ограниченную способность к пролиферации. Постепенное снижение скорости пролиферации клеток in vitro, приводящее в конечном счете к ее остановке, называют клеточным или репликативным (стационарным) старением. Ограниченность пролиферативной активности клеток была впервые показана более 40 лет назад L. Hayflick (1965) и оформлена как одна из теорий старения.
Старые клетки претерпевают характерные изменения в морфологии: становятся более крупными, плоскими и гранулированными. Эти клетки часто характеризуют по экспрессии бета-галактозидазы, активной при рН = 6 (лизосомальная гидролаза, в норме активна при рН = 4).
Более специфические биологические маркеры для определения репликативного старения разделяют на несколько категорий:
• компоненты сигнальных путей, которые индуцируют и поддерживают состояние старения (индукция ингибиторов циклин-зависимых киназ р16 и р21);
• маркеры генотоксического стресса (очаги повреждения ДНК и их колокализация с теломерами);
• появление характерного, ассоциированного со старением факультативного гетерохроматина;
• секреция определенных воспалительных цитокинов и факторов, модифицирующих ткань.
Стареющие клетки, как правило, сохраняют жизнеспособность и метаболическую активность в культуре в течение длительного времени. Считают, что состояние пролиферативного (репликативного) старения характеризуется необратимой утратой клетками, израсходовавшими пролиферативный потенциал, способности синтезировать ДНК в ответ на стимуляцию сывороткой или факторами роста, однако многие гены, связанные с пролиферацией, остаются в них способными к индукции митогенами. Блок пролиферации в этом случае может быть вызван либо отсутствием факторов, инициирующих вступление в S-период клеточного цикла, либо наличием в стареющих клетках ингибиторов пролиферации.
При пролиферативном старении отмечают отсутствие экспрессии некоторых генов, обеспечивающих выход клеток из состояния покоя. В стареющих клетках подавлена экспрессия циклинов, инсулиноподобного фактора роста (IGF-1) и некоторых других факторов роста.
Детерминированность процесса клеточного старения предполагает наличие специального молекулярного механизма, позволяющего клетке «отсчитывать» число пройденных удвоений. ДНК является единственной макромолекулой, обладающей достаточной стабильностью, чтобы служить базой такого механизма. Основой функционирования «молекулярных часов» считают изменения ДНК, сопряженные с процессом ее репликации: метилирование ДНК (определенных локусов) или потеря части ДНК в результате ее неполной репликации.
В последнее время роль «молекулярных часов» многие отводят теломерам линейных хромосом эукариотических клеток. Хромосомы позвоночных оканчиваются последовательностью ТТАGGG, повторенной в теломерах сотни и тысячи раз. Соматические клетки теряют от 50 до 200 нуклеотидов при каждом клеточном делении в результате неполной репликации концов хромосом из-за особенностей молекулярного механизма репликативного синтеза ДНК (А. М. Оловников, 1972, 2007). Отстающая цепь репликативной вилки в синтезе ДНК не может синтезироваться до 5'-конца в отсутствие рибопраймера, который, в свою очередь, не образуется непосредственно на концевом фрагменте. Потери концевой ДНК делают невозможной бесконечную пролиферацию.