В противоположность соматическим смертным клеткам, то есть клеткам, обладающим пределом размножения in vitro, большинство иммортальных клеток, обладающих способностью к бесконечной пролиферации, содержит теломеразу – фермент, достраивающий свободные 3'-концы хромосом короткими повторяющимися последовательностями (в случае позвоночных – TTAGGG). В репликативном старении существуют две фазы: так называемый «ранний кризис» (связан с активацией р53 и/или ингибиторов Cdk, возможно, в ответ на укорочение теломер до какого-то критического размера или какие-то другие сигналы) и так называемая «генетическая катастрофа» (очевидно, обусловлена полной дисфункцией теломер и слипанием хромосом). Оказалось, что при инактивации р53 (что характерно для большинства различных новообразований) «ранний кризис», несмотря на «нокаут» в эксперименте теломеразы и укорочение теломер, не наблюдается.
Активизация теломеразы обнаружена в стимулированных митогенами лимфоцитах, а также в пролиферативных зонах волосяных фолликулов и кишечных крипт.
Способность клеток и организмов реагировать на внешние стимуляторы постепенно уменьшается по мере старения. Наиболее вероятно, что основой изменения клеточной реакции на внешние воздействия по мере старения являются метаболические нарушения макромолекулярного синтеза.
Широко используемыми митогенами при изучении возрастных изменений клеточного ответа являются сыворотка, гормоны и факторы роста, такие как EGF, FGF, PDGF, инсулин и инсулиноподобный фактор роста (IGF-1), глюкокортикоиды.
Культуры клеток, полученные из тканей, взятых у пациентов, имеющих синдромы преждевременного старения, прогерии, – синдром Вернера и синдром Хатчинсона-Гилфорда – дают обычно значительно более низкий ответ на стимуляцию инсулином, FGF, PDGF и сывороткой, чем клетки здоровых людей.
Факторы роста и гормоны оказывают совместное действие, вызывая аддитивный эффект в «молодых» клетках, но не вызывают его в «старых». Показано, что синергичные эффекты дексаметазона и EGF или IGF-1, инсулина и гидрокортизона сильно снижены или отсутствуют в стареющих фибробластах, серийно пассируемых в культуре. Способность EGF, инсулина, IGF и сыворотки стимулировать синтез белка в культивируемых фибробластах также снижается по мере пассирования клеток. Индуцированный сывороткой уровень фактора элонгации-2 значительно ниже в «старой» культуре фибробластов человека, чем в «молодой». Экспрессия ассоциированного с пролиферацией ядерного антигена K-67 не индуцируется в «старых» фибробластах человека в ответ на действие PDGF, хотя она ярко выражена в «молодых». Белок Rb не фосфорилируется в «старых» фибробластах после стимуляции сывороткой, хотя фосфорилируется в «молодых» клетках.
Таким образом, не вызывает сомнения снижение чувствительности клеток к факторам роста по мере старения. Способность стареющих фибробластов к экспрессии мРНК генов, зависящих от клеточного цикла, таких как гены гистонов, орнитиндекарбоксилазы, тимидинкиназы, бета-актина, и протоонкогенов c-myc и c-ras остается неизменной, однако клетки при этом не могут вступать в S-фазу клеточного цикла. В то же время отмечено снижение активности белка орнитиндекарбоксилазы и отсутствие экспрессии c-fos при стимуляции стареющих фибробластов сывороткой.
Контроль репликативного старения – важный механизм антиопухолевой активности регуляторного белка p53. Фибробласты из p53-нокаутных мышей не стареют в культуре, продолжая неограниченно пролиферировать. При выведении иммортализованных стабильных клеточных линий p53 часто специально инактивируют, экспрессируя онкобелки ДНК-содержащих вирусов. Необратимая остановка пролиферации старых клеток сопровождается p53-зависимой транскрипционной активацией генов-мишеней p53. Активация p53 в старых клетках, по-видимому, происходит в ответ на хромосомные разрывы, ассоциированные с укорочением теломер в стареющих клетках.
Инактивация р53 способна задерживать, хотя и не отменять, репликативное старение в человеческих клетках. В старых клетках р53 мРНК и уровни белка по большому счету не изменяются, но р53 становится фосфорилированным и его активность как транскрипционного фактора повышается в процессе старения.
Одной из мишеней р53 является ингибитор циклин-зависимых киназ, белок р21. Экспрессия р21 повышается в процессе репликативного старения, и его активация зависит от сигналов, инициируемых укорочением теломер, поскольку экспрессия TERT блокирует эту активацию. Было обнаружено, что экспрессия р21 в течение репликативного старения регулируется двумя механизмами: р53-зависимым и 53-независимым. Гиперэкспрессия р21 индуцирует остановку клеточного роста в некоторых клетках, тогда как делеция р21 может отсрочить связанную со старением остановку клеточного роста. Совместно эти исследования говорят о том, что функции р53 в старении заключаются, по крайней мере частично, в индукции р21.
Ингибирование р53 и pRb дает возможность клеткам достигать более 50 делений. Эти результаты привели к развитию концепции, что существуют два пути, ответственных за индукцию старения клеток, и они действуют параллельно друг другу.
Белок pRb является центральным регулятором прохождения клеточного цикла. Гиперфосфорилированный pRb позволяет проходить клеточный цикл, тогда как гипофосфорилированный pRb предотвращает его прохождение; pRb преимущественно действует через инактивацию E2F семейства факторов транскрипции, ответственных за транскрипцию нескольких генов, вовлеченных в G1/S-переход и синтез ДНК. Фосфорилирование pRb зависит от циклин-зависимых киназ (CDK), которые управляют прохождением через разные фазы клеточного цикла. Инактивация G1 CDK, ответственных за фосфорилирование pRb, предотвращает переход из G1-фазы в S-фазу и блокирует клеточный цикл, индуцируя в том числе репликативное старение. Ингибиторы циклин-зависимых киназ (CDKI) ингибируют активность CDK; CDKI р16 нарушает и ингибирует активности CDK4 и CDK6, таким образом предотвращая прохождение клеточного цикла.
Экспрессия белка р16 увеличивается в некоторых старых человеческих фибробластах, и его индукция не всегда связана с укорочением теломер. Экспрессия р16 повышается после запуска старения в клетках, в отличие от быстрого увеличения экспрессии р21 в клетках, только входящих в состояние репликативного старения. Старая популяция человеческих клеток в культуре представляет собой некую мозаику, в которой некоторые клетки экспрессируют р16, тогда как другие экспрессируют р21. При этом индукция р16 не отменяется смещением экспрессии TERT, а функциональная инактивация р16 не предотвращает репликативное старение в человеческих фибробластах, что говорит о том, что р16 не связан с репликативным старением, опосредованным укорочением теломер. В ответ на укорочение теломер активация р21 может приводить к ингибированию фосфорилирования pRb, что выстраивает р53-р21 и pRb в один общий процесс.
Существуют примеры, что инактивация либо р53, либо pRb может существенно задерживать начало старения, подтверждая линейность пути р53-pRb. В других примерах необходимо ингибировать оба белка: и р53, и pRb, чтобы предотвратить начало репликативного старения в человеческих клетках, что говорит о наличии двух параллельных путей. Путь р53-р21-pRb преимущественно ответственен за старение, индуцированное укорочением теломер; путь р16-pRb, видимо, опосредует преждевременное старение, индуцированное стрессом. Вероятно, р53 и pRb-p16 пути работают совместно для остановки пролиферации клеток.
Возможно, существуют принципиальные молекулярные различия между обратимой остановкой в клеточном цикле и необратимой блокировкой, наступающей при старении, хотя эти различия пока полностью не выявлены.
Стволовые клетки при старении
Показано, что эмбриональные ткани являются источником уникальных по своим свойствам стволовых клеток (СК), обладающих высоким потенциалом к росту и дифференцировке. При попадании во взрослый организм эмбриональные стволовые клетки способны оказать глубокое влияние на все его органы и ткани. Трансплантация СК в последние годы прочно вошла в арсенал современных экспериментальных клинических подходов к лечению целого ряда наследственных и приобретенных заболеваний. Кроветворные СК используются для восстановления кроветворения у пациентов с онкологическими и гематологическими заболеваниями, инсультом, при травмах головного и спинного мозга, нейродегенеративных заболеваниях.
В эмбриогенезе человека и млекопитающих образование нескольких сотен вариантов специализированных клеток происходит из пула зародышевых листков (экто-, энто- и мезодермы), а также из эмбриональной мезенхимы.
Термин «стволовая клетка» определяет популяцию тканевых или циркулирующих в крови низкодифференцированных клеток-предшественников, обладающих неограниченной способностью к самообновлению и дифференцировке в клеточные компоненты различных тканей.
Терминология и классификация стволовых клеток в настоящее время находится в стадии становления. Наиболее важна классификация СК по источнику их выделения.
1. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) – внутриклеточная масса раннего эмбриона (на этапе бластоцисты – 4–7-й день развития).
2. Фетальные стволовые клетки (ФСК) – клетки зародыша на 9–12-й неделе развития, выделенные из абортивного материала.