Метилирование генома и возраст
Некоторые авторы подчеркивают значимость определенных процессов в хроматине, важных для старения, например, изменения степени метилирования генома.
По-видимому, метилирование ДНК препятствует взаимодействию регуляторных белков (факторов транскрипции) с промотором. Метилирование ДНК способствует привлечению к району промотора белков, подавляющих транскрипцию.
До 5 % всех остатков цитозина в ДНК млекопитающих метилировано по 5'-позиции с образованием 5-метилцитозина (5-мЦ). Это единственное постоянно модифицированное основание в ДНК высших эукариот. Метилирование происходит в обеих нитях ДНК симметрично, и остатки 5-мЦ всегда сопровождаются остатками гуанина со стороны 3'-конца.
Метилирование ДНК вовлечено в регуляцию активности генов. Изменения в метилировании, в частности деметилирование динуклеотидов у позвоночных, связаны с изменением уровня транскрипции. Возрастное деметилирование ДНК впервые описано в 1973 году Ванюшиным, когда была обнаружена разница в степени деметилирования в тканях крыс: в ткани мозга по сравнению с печенью оно было выше. В дальнейшем было показано возрастное снижение количества 5-мЦ в легких и культурах фибробластов кожи, для последних отмечена связь деметилирования со снижением возможности к росту в культуре. Было высказано предположение, что возрастное деметилирование предрасполагает клетки к опухолевой трансформации.
В настоящее время показано, что биологический возраст хорошо коррелирует с уровнем метилирования, но только для определенных участков генома. Не удалось связать продолжительность жизни организма с количеством повторяющихся или уникальных генов.
8-Окси-2'-дезоксигуанозин (8-одГ) является наиболее распространенным окислительным продуктом повреждения ДНК. Количество его при старении in vivo и in vitro непрерывно увеличивается как в ядерной, так и в митохондриальной ДНК (в последней – с гораздо более высокой скоростью), поэтому многие геронтологи, особенно стоящие на позициях свободнорадикальной теории старения, считают его одним из лучших молекулярных биомаркеров старения.
Электрокинетические свойства ядер
Трансмембранный потенциал ядер зарегистрирован в клетках различных организмов, он сохраняется в изолированных, выделенных из клеток ядрах. Электрокинетические свойства ядер, изолированных из клеток, в ряде случаев отражают изменения в активности синтетических процессов в клетках. Величина отрицательного мембранного потенциала ядра составляет порядка 43 В (клетки линии Hela) и изменяется в ходе клеточного цикла, омическое сопротивление мембраны ядра – порядка 1 Ом · см². В ходе индукции клеточного деления (например, при регенерации печени) электрокинетическая активность ядер значительно и рано возрастает, что зависит от синтеза РНК в клетках.
Электрокинетические свойства ядер и внутриядерных структур в живых клетках характеризуются с помощью показателей электроотрицательности ядер и хроматина, которые изменяются при изменении активности клеток и состояния организма и чувствительны к действию повреждающих факторов. Результаты исследований с помощью метода внутриклеточного микроэлектрофореза имеют также прикладное значение и находят применение в различных областях медицины при изучении утомляемости, выносливости человека в экстремальных условиях, неспецифических реакций организма на различные заболевания.
Исследования более 3000 доноров позволили определить зависимость величины электрокинетической активности ядер от возраста донора (Шахбазов и др., 1986). На рисунке 2 показано изменение данного показателя для клеток буккального эпителия в зависимости от возраста.
Видно, что с возрастом эта величина выраженно снижается, впрочем, график имеет заметный максимум в среднем возрасте, для более ранних возрастов эта величина более низкая. Последнее не позволяет напрямую связать электрический потенциал ядер с возрастом, однако снижение его при различной патологии и повышение при выздоровлении и улучшении общего и физического состояния позволяют говорить о нем как о важной и простой для регистрации величине, в т. ч. для определения биовозраста.
Данный феномен отмечен для большинства типов клеток и видов животных, поэтому он может быть использован и у лабораторных животных при исследовании процессов старения.
Рис. 2. Изменение количества электроотрицательных ядер (%) с возрастом (Шахбазов и др., 1990)
Изменяется и собственно электрическая активность клеток: удлиняется скрытый период включения моторной единицы, для групп клеток отмечается большое количество потенциалов малой силы. Значимо уменьшается количество воды в тканях, количество внутриклеточных ионов калия с неизменным или даже повышенным содержанием ионов натрия (в некоторых клетках, наоборот, происходит накопление внутриклеточного калия), падает мембранная активность К-Na-АТФазы, снижается содержание молекул – энергоносителей (АТФ и КФ – креатинфосфата), изменяется сопряжение окислительного фосфорилирования и окисления; в этих условиях растет компенсаторно внутриклеточный гликолиз, что приводит к накоплению кислых продуктов метаболизма и закислению внутренней среды клеток.
Резюме
Основными изменениями клеток при старении являются:
• регуляторное замедление скорости их деления ввиду снижения факторов роста (стационарное старение) и изменения микроокружения. Необновляющиеся (нервные и пр.) клетки с возрастом гибнут по стохастическому механизму и число их в тканях необратимо снижается. Снижение скорости клеточного деления проявляется как G1/S-блок деления клеток;
• наряду с процессами дегенерации (вакуолизация, нейрофагия, гиалиновая дегенерация, гидропическое набухание, вакуолизация и сморщивание, лизис и гиалиноз клеток с возрастом) происходит компенсаторная гиперплазия оставшихся клеток. Степень изменения клеток при старении даже одного типа различна;
• типичными являются атрофия капиллярного русла и развитие соединительной ткани, что приводит к тканевой гипоксии и дистрофии с возрастным склерозом ткани;
• типичны также отложения не до конца метаболизированных продуктов – липофусцина – в цитоплазме нервных клеток, конкреций в лизосомах и пероксисомах (метаболическое засорение клеток);
• изменяется функциональная активность (снижение лабильности и торпидность ответа, увеличение времени восстановительных процессов) клеток и их чувствительность к гормонам, число рецепторов к которым снижается;
• снижается чувствительность к апопотозу, что приводит к накоплению старых клеток. Некоторые клетки имеют врожденную запрограммированность способности к ограниченному числу делений («феномен Хейфлика»), в основе которой лежит механизм дефицита фермента теломеразы;
• число стволовых клеток, видимо, меняется мало и сохраняются их свойства, но снижается их циркуляция в крови и активность в тканях;
• изменения хроматина клеток отражают снижение скорости пролиферации и самообновления, репарации ошибок метаболизма: увеличивается ригидность хроматина и состав гистоновых/негистоновых белков, повышается выключающее гены метилирование ДНК, снижается активность ферментов репарации ДНК, накапливаются мутации и разрывы молекулы ДНК;
• увеличивается в крови содержание 8-Окси-2'-дезоксигуанозина (8-одГ) – наиболее важного для диагностики окислительного продукта повреждения ДНК;
• закономерное снижение электрокинетических свойств ядер клеток используют для диагностики биологического возраста.
Биохимия старения
Белковый обмен и ферменты при старении
Синтез белков разного типа мало изменяется с возрастом или часто меняется циклически в процессе всего онтогенеза, отражая в большинстве случаев изменения процессов центральной регуляции. Снижение протеолиза белков, часто отмечаемое в старости, наряду со снижением их синтеза, видимо, также является регуляторно-компенсаторным феноменом.
Были изучены разные аспекты функционирования ферментов как функции возраста: активность, изомеры, индукция, кинетические параметры и пр. Для многих ферментов никаких изменений не отмечено. Не выявлено никаких специфических закономерностей в изменении ферментов определенных классов, одного и того же органа или клеточной органеллы.
Часто наблюдаемые изменения в составе изоферментов отражают переключения с возрастом в работе генов: в старости работают часто другие гены, синтезирующие другие изоформы данного фермента. Сдвиг к Н4-ЛДГ в мозге, сердце и скелетных мышцах, отмеченный для крыс в старости, может сделать эти ткани более аэробными.
Измерение индукции ферментов, особенно стероидными гормонами, указывает, что в целом в старости степень индукции снижается. Снижение индукции ацетилхолинэстеразы эстрадиолом в старости происходит, скорее всего, за счет уменьшения уровня специфических для этого гормона рецепторов в ткани. Стимулирование регенерации, например печени, восстанавливает число таких рецепторов. Кинетические параметры ферментов (молекулярная масса, электрофоретическая подвижность, Км и др.) в большинстве случаев одинаковы для молодых и старых организмов. Однако удельная активность ферментов в пересчете на очищенный фермент часто снижается в старости, а их термочувствительность возрастает.
Характерное проявление общих принципов старения для «старения молекулы» – это снижение специфических функций и снижение степени резистентности к условиям внешней среды.
В целом большинство авторов резюмируют, что изменения уровня ферментов с возрастом являются вторичными, отражающими регуляторные изменения в организме.