Применение метода нокаута генов стало особенно актуальным в последние годы, после завершения секвенирования (прочтения последовательности) полных геномов человека и мыши, а также ряда других видов животных. Последовательно нокаутируя различные гены в пределах мышиного генома, исследователи выясняют функции каждого из них. Учитывая, что у человека и мыши очень многие гены сходны и выполняют одни и те же функции, «нокаутные» мыши предоставляют исследователям богатый материал для изучения роли генов в нормальном развитии и жизни человеческого организма и в патологических процессах.
В последние годы бурно развиваются исследования влияния мутаций в геноме мышей на продолжительность их жизни.
Факторы роста. Особые белки, участвующие в межклеточной сигнализации и называемые факторами роста (growth factors – GF), запускают внутриклеточные каскады фосфорилирования различных белков через активацию особых клеточных ферментов – протеинкиназ.
Наиболее изучен и, видимо, важен, инсулиноподобный фактор роста (IGF-1), связывание которого с рецептором инсулина/IGF-1 на клетке активирует на внутренней мембране ее фосфоинозитол-3-киназу, что приводит к образованию низкомолекулярного посредника – фосфоинозитид-3,4,5-трифосфата, который связывается с другой киназой (3-фосфоинозитид-зависимая киназа 1 или PDK-1) и активирует (фосфорилирует) киназы Akt/PKB и SGK-1, что позволяет протекать нормальным ростовым процессам в клетке. Параллельно выключаются факторы стрессоустойчивости, такие как транскрипционный фактор FOXO. То есть наравне с нормальным ростом клетки при благоприятных условиях питания снижается стрессоустойчивость, что ускоряет старение.
Мутации генов перечисленных киназ, или сверхэкспрессия фосфатазы PTEN, блокирующей каскад этих киназ, продлевают жизнь модельным животным. При этом у мутантных животных снижаются размеры тела и скорость метаболизма.
Еще одно семейство киназ – TOR, высококонсервативное от дрожжей до человека; оно участвует в регуляции многих клеточных процессов в присутствии достаточного количества питательных веществ: роста клетки, автофагии, биогенеза рибосом, трансляции, метаболизма углеводов и аминокислот, стресс-ответа.
Выключение функции компонентов TOR-каскада фосфорилирования продлевает жизнь модельным животным – нематодам и дрозофилам, – что может быть связано с переключением программы развития и роста на программу поддержания жизнеспособности в условиях стресса, как и в случае с вышеописанным инсулин/IGF-1-сигналингом.
Стресс-индуцируемые протеинкиназы (JNK, MST-1).JNK- и MST-1-зависимые каскады фосфорилирования выполняют эволюционно-консервативную (у нематод, дрозофил, млекопитающих) функцию регуляции различных форм устойчивости к стрессам через активацию транскрипционных факторов FOXO и HSF-1. В результате сверхактивации JNK обычно наблюдается увеличение продолжительности жизни.
Деацетилазы белков (Sir2/SIRT1, Rpd3/HDAC). Деацетилазы семейства Sir2/ SIRT1 (сиртуины) в ответ на стрессовые воздействия подавляют проапоптозную функцию транскрипционных факторов р53 и FOXO, а также репрессируют гены, контролирующие участие эндоплазматической сети в стресс-ответе, способствуя выживаемости клетки и увеличению продолжительности жизни. Другая деацетилаза, Rpd3/HDAC, напротив, способствует старению, а мутация ее гена, выключающая ее активность, продлевает жизнь.
Транскрипционные факторы, обеспечивающие устойчивость к стрессам (FOXO, HSF-1). Группа белков FOXO играет важную роль в ответе на различные виды стресса и регулирует широкий спектр реакций клетки: изменение метаболизма, дифференцировку, апоптоз и старение. В результате дефосфорилированный транскрипционный фактор FOXO перемещается в ядро, что приводит к остановке роста клетки (через транскрипцию гена р27 – ингибитора циклин-зависимых киназ) и увеличению устойчивости к стрессу, повышая продолжительность жизни организмов.
К FOXO-регулируемым относятся такие гены продолжительности жизни, как гены супероксиддисмутазы и каталазы, аполипопротеина C–III, белков теплового шока и белка репарации GADD45. Сверхактивация генно-инженерными методами некоторых из этих генов (супероксиддисмутазы, каталазы и белков теплового шока) способна приводить к увеличению продолжительности жизни модельных животных.
Еще один транскрипционный фактор, HSF-1, индуцируется в ответ на тепловой шок и контролирует гены ответа на стресс, ответственные за увеличение продолжительности жизни, такие как гены малых белков теплового шока. HSF-1 генетически взаимодействует с FOXO, по крайней мере у нематод.
Гормон Klotho. Мутация в гене Klotho приводит к уменьшению, а сверхэкспрессия – к увеличению продолжительности жизни мышей. Кодируемый данным геном пептидный гормон ингибирует эффекты инсулин/IGF-1-пути, увеличивая устойчивость к окислительному стрессу на уровне клетки.
Адапторный белок p66(Shc). У мышей с мутацией в гене p66 наблюдается увеличение продолжительности жизни. В норме этот ген, в ответ на р53-зависимую активацию, увеличивает выработку активных форм кислорода в клетке и вызывает ее апоптоз.
Другие гены долголетия. Помимо вышеперечисленных генов, к долгожительству модельных животных могут приводить:
• сверхэкспрессия генов репарации окисленных белков (метионинредуктазы), генов протеосомы, автофагии,
• а также выключение ряда митохондриальных белков (например, субъединиц белков электронотранспортной цепи) и регуляторов функции рибосом.
В то время как сверхактивация первой группы генов позволяет эффективнее утилизировать внутриклеточный «мусор», накапливающийся в постмитотических клетках с возрастом, ингибирование генов второй группы позволяет замедлить метаболизм, сэкономив энергетические ресурсы.
Естественные полиморфизмы и продолжительность жизни. До сих пор нет четкого ответа на вопрос, полиморфизм каких генов является причиной внутривидового варьирования продолжительности жизни. На эти вопросы позволяет ответить исследовательский подход, получивший название «анализ локусов количественных признаков» (QTL).
Анализ QTL у нематод, дрозофил и мышей привел к обнаружению десятков генов, вовлеченных в естественный полиморфизм ПЖ, и подтвердил участие в естественном полиморфизме ПЖ практически всех известных «геронтогенов». Анализ QTL позволил выявить и ряд новых генов, связанных с долгожительством. У дрозофил с помощью QTL была обнаружена причастность к старению генов дофа-декарбоксилазы (Ddc), а также генов Shuttle craft (stc) и ms(2)35ci. Ген Ddc кодирует фермент, необходимый для выработки дофамина и серотонина в ЦНС и гиподерме. Ген stc, экспрессируемый в мозге и яичниках мух, является гомологом человеческого гена NF-X1, кодирующего транскрипционный фактор РНК полимеразы II.
О гене ms(2)35Ci известно только то, что это рецессивная аллель, в гомозиготе приводящая к стерильности самцов.
Резюме
Продолжительность жизни является видовым признаком, что дает основание для применения генетических методов изучения старения. Классические методы – исследование наследуемости долгожительства и врожденных прогерий. Современные методы основаны на методах генной инженерии и направлены на:
• выяснение основной группы генов, определяющих нормальное старение и долгожительство их аллелей;
• выяснение генов наследуемости преждевременного старения, генных моделей старения;
• выявление генов клеточного старения;
• изучение генов, которые могут быть биомаркерами старения (изменение экспрессии генов с возрастом);
• изучение генов естественного полиморфизма продолжительности жизни внутри вида;
• изучение видоспецифических генов долголетия.
Типичным примером генетически ускоренного старения являются мыши с геном Klotho: мутация мембранного белка типа бета-гликозидазы вызывает проявления ускоренного старения – укорочение жизни, гипокинезию, бесплодие, артериосклероз, облысение, атрофию кожи и тимуса, снижение числа клеток гипофиза, продуцирующих гормон роста.
Исследование долгожительства показало, что имеющие обоих родителей, доживших до 80 лет, получают дополнительно порядка 5 лет ПЖ. Наличие одного родителя-долгожителя дает значительно меньшую вероятность долгожительства у детей. У монозиготных близнецов ПЖ различается в пределах 3 лет.
На примере 90-летних предполагают важную роль сочетания нескольких генов долголетия: кодирующий инсулиноподобный фактор роста, цитокины, ферменты антиоксидантной системы, метаболизм липидов (характерно для долгожителей большое количество липопротеинов высокой плотности). Важную роль отводят центральному гену апоптоза bcl-2, блокирующему программируемую смерть клетки, в т. ч. от оксидативного стресса.
Для частичных прогерий обычно характерно:
• нарушение репарации и репликации ДНК, генетическая нестабильность;
• нарушение свойств теломер, хроматина и ядра клетки;
• нарушение экспрессии генов;
• репликативное старение клетки;
• повышенная чувствительность к апоптозу;
• элиминация стволовых клеток;
• наличие коротких теломер.
В основе современных методов нокаута генов и трансгенных мышей лежит явление гомологичной рекомбинации – обмена соответствующими участками между парами гомологичных хромосом, а также синтез нужных участков генов. На основе этого метода получены данные о роли в естественном и преждевременном старении генов, ответственных за самые различные процессы жизнеобеспечения: