Первая линия доказательств связана с эволюционным деревом. Сходство последовательностей генов 16 дыхательных белков можно использовать для построения дерева жизни, а затем совместить его с деревом, созданным по последовательности рибосомной РНК. Если гены дыхательных белков передавались за счет горизонтального переноса генов, родственные гены дыхательных белков можно обнаружить у видов с очень дальним родством. Иными словами, в этом случае пути эволюции генов дыхательных белков должны отличаться от путей эволюции организмов-хозяев — как история митохондриальных генов отличается от истории ядерных генов эукариот. Если же гены дыхательных белков не передавались путем горизонтального переноса, тогда эволюционные деревья, построенные на основе рибосомной РНК и генов дыхательных белков, должны совпадать. Тик оно и оказалось: эволюционные деревья проанализированных до сих пор генов дыхательных белков в основном соответствовали дереву, построенному на основе анализа рибосомной РНК. Это означает, что между бактериями и археями не происходило горизонтального переноса генов.
Вторая линия доказательств связана с более новыми метаболическими способностями, такими как фотосинтез. LUСА, судя по всему, не умел осуществлять фотосинтез. У архей не обнаружено никаких форм фотосинтеза, связанных с использованием хлорофилла. Так называемые галобактерии (семейство архей, обитающих в среде с высокой концентрацией соли) используют совершенно иную форму фотосинтеза, основанную на действии фоторецепторного пигмента бактериородопсина, напоминающего фоторецепторные пигменты наших глаз. У бактерий такая форма фотосинтеза неизвестна. Две формы фотосинтеза в бактериях и археях, по-видимому, эволюционировали независимым путем после отделения от LUCА. Если столь важные метаболические инновации, как фотосинтез, не передаются из одного домена в другой, вряд ли передаются другие формы дыхания. Таким образом, вид эволюционных деревьев не позволяет обнаружить следов обмена генами дыхательных белков между доменами.
Если обмен генами между бактериями и археями является редчайшим событием, значит, LUСА уже имел 16 генов дыхательных белков, которые затем были унаследованы различными линиями бактерий и архей. Поскольку эти гены кодируют белки, участвующие в производстве энергии из таких соединений, как нитриты, нитраты, сульфиты и сульфаты, LUCA, судя по всему, был достаточно сложным в метаболическом плане организмом. Последовательности одного из 16 генов обладают наиболее сильно выраженным сходством в клетках бактерий и архей, и именно этот ген Кастрезана и Сарасте использовали для создания портрета LUCA.
Этот ген кодирует метаболический фермент цитохромоксидазу, осуществляющий перенос электронов на молекулу кислорода (с образованием воды) на последней стадии дыхательной цепи. Если у LUСА была цитохромоксидаза, приходится заключить (хотя это, казалось бы, противоречит здравому смыслу), что аэробное дыхание появилось раньше фотосинтеза. Иными словами, LUCA имел возможность дышать до того, как в воздухе появился кислород! Кастрезана и Сарасте, несомненно, оценили значение этого открытия: «Доказательства того, что аэробное дыхание могло эволюционировать до выделения в атмосферу кислорода фотосинтезирующими организмами, противоречат тому, что сказано в учебниках».
Механизм восстановления кислорода при участии цитохромоксидазы — чудо наноинженерии. Фермент использует электроны, выделяющиеся при окислении глюкозы. Он поочередно передает четыре электрона и четыре протона на молекулу кислорода, в результате чего образуются две молекулы воды. Эта реакция противоположна реакции расщепления воды при фотосинтезе:
Реакция соединения водорода с кислородом — самая важная стадия процесса аэробного дыхания. Возможно, многие помнят демонстрацию этой реакции на уроке химии, поскольку она сопровождается взрывом. Как и во всех реакциях с участием кислорода, электроны передаются по одному. Поэтому сложнейшая задача цитохромоксидазы заключается в том, чтобы cобpать выделяющуюся энергию, но не допустить утечки свободных радикалов. И эта задача выполняется с высочайшей точностью. В митохондриях современных организмов цитохромоксидаза практически не выпускает свободных радикалов (все свободные радикалы ухитряются сбежать из других белковых комплексов электронтранспортной цепи). Благодаря способности впитывать весь кислород и превращать его в воду, не допуская выделения токсичных промежуточных продуктов, цитохромоксидазу можно считать мощнейшим антиоксидантом, не имеющим себе равных. Дополнительным преимуществом данного процесса является извлечение из молекулы глюкозы четырехкратного количества энергии по сравнению со всеми другими формами дыхания.
На протяжении многих лет эволюцию цитохромоксидазы связывали именно с ее антиоксидантным действием. Фермент изначально возник при повышении содержания кислорода в воздухе в результате фотосинтеза и только потом стал использоваться в качестве дыхательного фермента. Такой сценарий подтверждался наличием второй (несвязанной в эволюционном плане) формы цитохромоксидазы у некоторых протеобактерий, включая Еscherichia coli и Azotоbacter vinelandii. Вторая форма в сто раз менее избирательна по отношению к кислороду (она, в частности, не отличает кислород от таких молекул, как оксид азота NО), но работает намного активнее, очень быстро перерабатывая избыток кислорода. Более того, эта оксидаза включается только тогда, когда бактерия попадает в среду с высоким содержанием кислорода, где действует как пылесос, засасывая кислород и аналогичные молекулы.
Таким образом, активность цитохромоксидаз двух типов зависит от содержания кислорода в среде. Действительно очень похоже, что эти ферменты появились для защиты клеток от кислорода. В таком случае ревизионистская гипотеза Кастрезаны и Сарасте повисает в воздухе. Если у LUCA была цитохромоксидаза, она не могла возникнуть в ответ на повышение концентрации кислорода, которое произошло только через миллиард лет. Так как и зачем появился этот фермент? В главе 7 мы говорили о том, что озера и мелкие моря находились в состоянии окислительного стресса, вызванного ультрафиолетовым излучением, расщеплявшим воду с образованием свободных радикалов кислорода и пероксида водорода. Такие ферменты-антиоксиданты, как супероксиддисмутаза (СОД), найдены у представителей всех трех доменов жизни и, вполне вероятно, могли быть у LUCA. Возможно, цитохромоксидаза тоже возникла как средство защиты от ультрафиолетового излучения, а не в ответ на повышение концентрации кислорода в воздухе?
Точного ответа мы не знаем, но, скорее всего, это не так. Если бы данный фермент возник как антиоксидант для защиты от ультрафиолетового излучения, его функция в дыхательной цепи (накопление энергии от передачи электронов кислороду, а не только поглощение газообразного кислорода) эволюционировала бы позднее независимым путем в различных ветвях бактерий и архей. В таком случае эти группы клеток должны иметь разные механизмы накопления энергии. Однако механизмы чрезвычайно похожи и поэтому унаследованы от общего предка[52]. Таким образом, если исходно цитохромоксидаза возникла не как антиоксидант, значит, она была нужна для реализации ее теперешнего предназначения — получения энергии от передачи электронов на молекулу кислорода. Вам такой сценарий кажется более правдоподобным? Мы видели, что окислительный стресс без кислорода возможен, но можно ли представить себе кислородное дыхание без кислорода? Все зависит от того, что значит «без кислорода». Понятие «аноксические условия» (отсутствие кислорода) чрезвычайно расплывчатое и для геологов, зоологов и микробиологов имеет разное значение. Геологи называют «аэробной средой» такую среду, в которой содержание кислорода не ниже 18% современного содержания кислорода в атмосфере, а «дизаэробной средой» они называют среду с более низким содержанием кислорода. Среду с содержанием кислорода менее 1% геологи называют «азоической» или «аноксической». Зоологи говорят о «нормоксических» и «гипоксических» условиях: гипоксией называют такое содержание кислорода, при котором нарушается процесс дыхания, обычно это ниже 50% современного содержания кислорода в атмосфере. Микробиологи оперируют другими терминами, в частности, используют такой показатель, как точка Пастера — концентрация кислорода, при которой некоторые микроорганизмы переключаются с аэробного дыхания на брожение (обычно ниже 1% современного содержания кислорода в воздухе). Однако некоторые микробы дышат кислородом даже при его очень низком содержании в воздухе, ниже 0,1% нормального уровня. Такие условия — очевидно аноксические для геологов — вполне могли существовать на древней Земле, особенно в мелких водоемах за счет расщепления воды.
Удивительно, что некоторые современные микроорганизмы способны использовать кислород в еще более низкой концентрации. Например, некоторые виды протеобактерий живут в симбиозе с бобовыми растениями, поселяясь в их клубеньках. В обмен на кров и защиту они снабжают растения нитратами, которые синтезируют из азота воздуха. Активность нитрогеназы, катализирующей эту реакция, ингибируется кислородом даже в очень низкой концентрации. Бобовые растения и азотфиксирующие бактерии устроены таким образом, чтобы поддерживать минимальную концентрацию кислорода в клубеньках. Бактерии окружают себя толстым слоем слизи, препятствующей проникновению кислорода. Если этой защиты недостаточно, они активируют фермент, который быстро захватывает кислород, не производя энергии. Бобовые растения синтезируют родственный гемоглобину кислород-связывающий фермент леггемоглобин, регулирующий концентрацию свободного кислорода. Благодаря этим адаптациям уровень кислорода в клетках бактерий ниже 0,01% атмосферного уровня, так что кислород не мешает действию нитрогеназы.
Удивительно, что при всех этих адаптациях, призванных минимизировать концентрацию кислорода, некоторые азотфиксирующие бактерии, такие как