Кратко напомним, что такое аминокислоты. Это органические молекулы, содержащие аминогруппу H2N– и кислотную карбоксильную группу – СООН. Те аминокислоты, из которых собираются белки, имеют отличительный признак: между аминогруппой и карбоксильной группой находится всего один атом углерода. Общий вид всех природных аминокислот NH2-CR2-COOH. Органические заместители R у центрального атома углерода могут быть различными, в том числе и атомы водорода. При образовании белковых молекул концевая аминогруппа взаимодействует с концевой карбоксильной группой соседней молекулы с выделением воды:
NH2-CR2-COOH + NH2-CR'2-COOH → NH2-CR2-CO-NH-CR'2-COOH
Именно таким образом наращивается цепочка белковой молекулы. Кстати, при получении широко известных в быту полиамидов (например, нейлона) используют подобную простую реакцию: молекула с двумя аминогруппами на концах H2N-(CН2)n-NH2 взаимодействует с молекулой, имеющей две карбоксильные группы HCOO-(CН2)n-COOH (подробнее о полиамидах рассказано в главе «Империя длинных молекул»).
Перейдем к образованию хромофорной группы в GFP. Она собирается из трех аминокислот: тирозина, глицина и серина (рис. 2.9), которые присутствуют в каждом живом организме. Три молекулы объединяются в единый реагирующий центр. Две аминокислоты из трех (глицин и серин) присутствуют не в виде свободных молекул, а в качестве "привесков" к внутренней полости основного цилиндра (на рис. 2.9 это показано с помощью волнистых линий). Далее все происходит точно таким же образом, как описано выше: карбоксильная группа тирозина реагирует с аминогруппой глицина, а аминогруппа тирозина взаимодействует с гидроксильной группой серина (реагирующие группы обведены штриховыми прямоугольниками), при этом выделяются две молекулы воды. Далее реагируют две аминогруппы и карбонильный кислород (обведены г-образным штриховым контуром), образуется пятичленный цикл, называемый имидазольным, с двумя атомами азота и двойной связью, и вновь выделяется молекула воды. На последней стадии молекула кислорода отрывает два атома водорода от двух атомов углерода, показанных на предпоследней стадии в виде утолщенных точек (рис. 2.9). Выделяется молекула воды, и в итоге образуется хромофорная группа. Несмотря на то что строение всей образовавшейся группы можно назвать достаточно сложным, реакции, ведущие к ее образованию, весьма просты, а исходные реагенты – хорошо известные природные аминокислоты.
Показанный на рис. 2.8а белковый цилиндр не только служит "реакционной колбой" для получения хромофорной группы, но и защищает ее от случайных химических воздействий.
В нашем рассказе появляется драматический поворот: настало время упомянуть имя ученого, без которого исследования могло и не быть. Тем не менее он не стал нобелевским лауреатом. Впрочем, все три лауреата в своих нобелевских докладах с глубоким уважением упомянули его имя. Первым, кто осознал возможности GFP, был американский биохимик Дуглас Прашер – ему пришла в голову интересная идея выделить ген ДНК, который обеспечивает в медузах синтез GFP, а затем ввести его в другие организмы. В результате такой организм начнет синтезировать белки с флуоресцирующим хвостом (своеобразным фонариком). Облучая объект ультрафиолетовым светом, можно будет заметить, где синтезируется и в какие участки клетки направляется белок с «зеленым фонариком» на конце.
Идея оказалась замечательной, и главное – со временем ее удалось реализовать. Сложность состояла в том, что нужно было выделить не сам флуоресцентный белок (это уже проделал ранее Симомура), а ген – участок ДНК, который в организме медузы эквореи отвечает за синтез GFP. В 1992 г. Прашеру удалось выделить нужный ген и определить в нем последовательность групп, которые кодируют синтез зеленого белка. К сожалению, Прашер не смог продолжить исследования (такое часто бывает в науке): финансирование работ было прекращено и работа приостановлена. Эстафету принял другой американец, второй лауреат упомянутой Нобелевской премии – Мартин Чалфи. Узнав на одной из конференций о работах Прашера, он связался с автором работы и получил от него необходимую информацию вместе с образцами.
Чалфи проводил исследования, используя в качестве модельных организмов специальных круглых полупрозрачных червячков (латинское название – Caenorabditis elegans). Они около 1 мм в длину, их движения (судя по имеющимся видеороликам и в полном согласии с латинским названием) достаточно элегантны. Эти червячки, состоящие точно из 959 клеток, очень подробно изучены биологами и считаются одними из наиболее подходящих объектов для экспериментов. Чалфи решил ввести в структуру ДНК изучаемых червей ген ДНК – тот, который он получил от Прашера и который кодирует в медузах синтез GFP. В итоге Чалфи удалось внедрить этот ген в живые клетки изучаемого червячка. Полученный результат произвел на исследователей очень сильное впечатление: снимок червячка со светящимися участками тела был помещен на обложке одного из самых авторитетных научных журналов – Science.
После этого во многих странах количество исследовательских работ с флуоресцирующим белком стало стремительно расти. Ген, вводящий в живой организм светящуюся метку, стали называть репортерным. Он позволил проводить тонкие исследования с различными генетически модифицированными организмами, причем объект не требовалось препарировать или каким-либо образом разрушать – стало возможным наблюдать многие скрытые процессы визуально. Впервые ученые смогли под микроскопом следить в режиме реального времени, например, за ростом и характером связей в нейронах или за распространением раковых клеток в организмах лабораторных животных.
Многие исследователи отмечали, что при воздействии ультрафиолетового света флуоресцентные белки постепенно «портятся», и флуоресценция гаснет. Третий лауреат премии – Роджер Тсиен, американец китайского происхождения, описал схему синтеза хромофорной группы (она была показана на рис. 2.8) и затем нашел способы целенаправленно изменять ее структуру для того, чтобы сделать более стабильной, а флуоресценцию – более яркой. Фактически это была необычайно тонкая работа химика-синтетика. Более того, он разработал способы получения хромофорных групп, которые флуоресцируют разными цветами, благодаря чему можно одновременно следить за несколькими процессами, происходящими в живых клетках, – например, различать раковые и нормальные клетки. В настоящее время эти белки используют практически в любой лаборатории, где ведутся исследования в области молекулярной биологии или биологии клетки.
Далеко не каждая серьезная научная работа имеет впечатляющее красочное продолжение – причем в той области, которая понятна почти каждому человеку, в том числе и далекому от науки. Имея широкий набор цветных белков, ученые стали вводить флуоресцирующий ген в организмы разных животных, и в результате отдельные участки тела (или даже весь организм) стали светящимися. Научные журналы запестрели цветными снимками флуоресцирующих мушек дрозофил, кроликов, обычных и летучих мышей.
Особенно сильное впечатление произвело сообщение группы тайваньских биохимиков, которые под руководством профессора Шинь-Джи в 2006 г. создали флуоресцирующих поросят, для чего потребовалось с помощью необычайно тонкой экспериментальной техники ввести соответствующие гены в эмбрионы свиней. Эти поросята при дневном свете имеют отчетливый зеленоватый цвет кожи и глаз. Более того, у них даже сердце и внутренние органы – зеленого цвета! В других опытах они имеют ярко окрашенные оранжевые пятачки.
Подобные научные достижения настолько впечатляющи, что привлекают внимание не только ученых, но и широкой публики. Тем не менее все это было проделано не для внешнего эффекта. Опыты с различными биологическими тканями свиней наиболее точно моделируют соответствующие процессы в тканях человеческого организма. Основная цель выведения таких свиней – визуальное наблюдение за развитием тканей при пересадке стволовых клеток. Кратко поясним, что ставшие в последнее время популярными стволовые клетки после введения в организм находят поврежденную зону, далее изменяются в зависимости от того, где они находятся, то есть приобретают нужную "специализацию" и начинают развиваться, как обычные клетки. Иными словами, они могут наращивать поврежденный орган. С помощью цветных индикаторов можно будет определять, получил ли организм генетическую вставку, введенную методами генной инженерии. При изучении онкологических заболеваний стало возможным следить за развитием здоровых и больных клеток.
Факт присуждения Нобелевской премии всегда сопровождается восторженными отзывами научной общественности в газетах, журналах, на телевидении и на радио. В большинстве случаев такое вполне оправданно, однако ничто не мешает нам взглянуть на эту ситуацию более спокойно. Фактически был найден изящный аналитический метод, позволяющий следить буквально своими глазами за теми процессами, которые происходят в живых организмах, при этом какое-либо внутреннее механическое вмешательство не требуется и жизненные процессы никак не нарушаются. Можно ли все это рассматривать как выдающиеся фундаментальные работы? Академик РАН Евгений Свердлов (заведующий лабораторией структуры и функции генов человека в Институте биоорганической химии РАН) считает, что открытие и использование зеленого флуоресцентного белка сыграло очень большую роль в биологии, хотя, по мнению академика, до нобелевского масштаба оно не дотягивает и не вносит революционных изменений в биологические исследования. Академик поясняет, что до появления зеленого флуоресцентного белка использовались другие светящиеся метки – например, так называемая люцифераза, это фермент, в котором для свечения используется энергия химической реакции.