Разделение первого комплекса происходит только после того, как связанная с комплексом молекула ГТФ химически расщепляется до ГДФ и иона фосфата. До гидролиза ГТФ взаимодействие тРНК с мРНК относительно слабое. Таким образом, гидролиз ГТФ с участием комплекса служит лимитирующим фактором, дающим время для проверки, правильно ли связана тРНК. Затем следующий белок, фактор элонгации, катализирует обмен ГДФ на ГТФ и таким образом регенерирует способность рибосомы полимеризовать аминокислотную цепь. После передвижения растущей аминокислотной цепи внутри рибосомы свободная аминоацил-тРНК отсоединяется от рибосомы.
С рибосомой связывается другой ГТФ-содержащий фактор удлинения. Гидролиз (химическое разрушение с поглощениме молекул воды) ГТФ этим фактором дает энергию для транслокации рибосомы. Во время этого процесса рибосома сдвигает мРНК на три основания в направлении 3'-конца. Поскольку тРНК, несущая полипептидную цепь, не меняет положения относительно мРНК, она попадает в 2-й участок рибосомы, в то время как следующий кодон мРНК попадает в 1-й участок. Теперь рибосома готова для вступления в следующий цикл удлинения и процесс повторяется. По мере трансляции рибосома движется по направлению к 3'-концу до тех пор, пока не дойдет до терминирующего кодона (стоп-кодона) (УАГ, УАА, УГА). После завершения стадии инициации к растущей полипептидной цепи присоединяются другие аминокислоты до тех пор, пока рибосома не достигнет стоп-кодона на мРНК и процесс не прекратится (терминация). Когда один из стоп-кодонов (УАГ, УАА, УГА) попадает в зону синтеза, удлинение полипептидной цепи заканчивается. Для стоп-кодонов нет соответствующих тРНК. Как только рибосома достигает стоп-кодона, происходит освобождение синтезированного белка и распад рибосомы на отдельные субчастицы.
II.15. СИНТЕЗ БЕЛКОВ В ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ СЕТИ
Растворимые, то есть не связанные напрямую с липидной мембраной белки, могут быть предназначены для выведения во внешнюю среду или для доставки в лизосомы, пластинчатый комплекс или они могут оставаться в эндоплазматической сети (ЭС). Эти белки называются секретируемыми. Небольшая часть растворимых белков, оказывающихся в просвете эндоплазматической сети, являются лизосомными ферментами, они предназначены для доставки в лизосомы. Наконец, есть белки, которые остаются в просвете ЭС. К ним относятся некоторые шапероны, белки, ответственные за правильную трехмерную упаковку белковых молекул, а также участники специализированных для ЭС белковых агрегатов, контролирующих выход секретируемых белков и лизосомных ферментов из ЭС.
В гранулярной же ЭС происходит синтез экспортируемых белков, которые, встраиваясь в мембрану ЭС, становятся интегральными мембранными белками. Мембранные белки могут быть следующих типов. Одни переносятся на митохондрии, другие остаются в ЭС или транспортируются в пероксисомы. Наконец, третья часть белков транспортируется в сторону аппарата Гольджи и проходит через него, направляясь либо на плазматическую мембрану, либо в эндосомы, либо в лизосомы. Сходный путь проходят липиды, продуцируемые на цитозольной стороне мембран ЭС.
II.16. СИГНАЛЬНЫЙ ПЕПТИД
Белковая машина, ответственная за внедрения секретируемых (растворимых) и экспортируемых (мембранных или растворимых, но предназначенных для других органелл клетки) белков в просвет эндоплазматической сети или (во втором случае) в его мембрану, работает следующим образом. После того, как информационная мРНК проникает из ядра в цитоплазму, она связывается с рибосомой.
Биосинтез белка (трансляция мРНК) всегда начинается в цитоплазме после приклеивания мРНК к рибосоме и сборки рибосомы из двух частиц. Если в мНК нет специальной последовательности нуклеотидов, которая называется сигнальным пептидом, то синтез проходит нормально и аминокислотная цепь оказывается в цитоплазме, где она потом образует трехмерную структуру и подвергается посттрансляционной (то есть уже после синтеза) модификации.
Если же образующийся на рибосоме белок начинается с сигнального пептида, то рибосома вместе с мРНК прикрепляется к эндоплазматической сети. Сигнальный пептид — это короткая цепочка из особой последовательности аминокислот на том конце белка, где началом служит атом азота. За открытие сигнального пептида Блобелю была присуждена Нобелевская премия (1999 г.).
Наличие сигнального пептида определяет судьбу полипептидной (белковой) цепочки, синтезирующейся на базе данной информационной РНК. Если сигнальный пептид у данного белка есть, то комплекс рибосомы и информационной РНК и начинающая полипептидная цепочка присоединяется к специальным белковым машинам, ответственным за перенос полипептидной цепочки через мембрану эндоплазматической сети. В направлении сигнального пептида к мембране эндоплазматической сети участвуют 1) частица, распознающая сигнал (a signal-recognition particle, SRP, СПР) и 2) ее рецептор, известный также как стыкующий белок.
II.17. ТРАНСЛОКОН
С сигнальным пептидом связывается РНК-содержащая сигнал-узнающая частица СПР (SRP) и трансляция (синтез белка) временно прерывается. SRP связывает рибосому посредством SRP-рецептора с мембраной ШЭР. SRP плотно захватывает рибосому, присоединяясь и к сигнальному пептиду (как только он появляется на большой субъединице рибосомы), и к рибосомному участку связывания аминоацил-тРНК. В результате трансляция останавливается, поскольку блокируется связывание следующей аминоацил-тРНК с рибосомой.
Пауза в трансляции длится до тех пор, пока захватившая рибосому частица не свяжется с SRP-рецептором, находящемся на цитоплазматической стороне мембраны шероховатой эндоплазматической сети. Он взаимодействует с SRP-связанными рибосомами таким образом, что частица меняет свое положение, и трансляция возобновляется. Одновременно рибосома связывается с мембраной эндоплазматической сети и растущая на ней полипептидная цепь переносится к системе транслокации в мембране. Как только рибосома закрепится на мембране, SRP-частица отщепляется от сигнального пептида и от SRP-рецептора (при этом гидролизуется ГТФ), и на рибосоме вновь начинается процесс трансляции.
Транслокон — пора, образованная мембранными белками эндоплазматической сети в месте нахождения сигнальной последовательности синтезируемого белка. После прикрепления рибосомы к мембране удлинение полипептидной цепи начинается и цепь проходит через пору в просвет цистерны. Полипептидная цепь синтезируется в цитоплазме. Сигнальная последовательность остается фиксированной в области поры. В последующем она отрезается специальными ферментами, находящимися в эндоплазматической сети. У меня нет возможности подробно разбирать функционирование этой сложнейшей белковой машины, которая носит название транслокон. Тех, кто интересуется, отсылаю к прекрасным обзорам (157, 234).
Белковый комплекс, ответственный за перемещение полипептидной цепи через мембрану эндоплазматической сети состоит из нескольких отдельных белков, но его главным компонентом является белок Сек61. После того, как рибосома прикрепилась к мембране эндоплазматической сети, полипептидная цепочка, синтезирующаяся на основе информационной РНК захватывается Сек61 и через образуемый им в мембране эндоплазматической сети гидрофильный канал проталкивается внутрь просвета эндоплазматической сети.
Такая "заякоренная" рибосома с SRP-частицей, блокирующей дальнейший рост полипептидной цепи, взаимодействует с большим белковым комплексом, транслоконом. После связывания рибосомы с транслоконом происходит отделение SRP-частицы и синтезированный первичный пептид входит в канал диметром около 2 нм, который образует транслокон. После этого возобновляется синтез полипептида, он удлиняется и его сигнальная последовательность, вместе с растущей цепочкой оказывается внутри полости цистерны эндоплазматической сети. Таким образом, синтезируемый белок проходит сквозь мембрану эндоплазматической сети во время его синтеза, т. е. котрансляционно, то есть одновременно с его трансляцией.
После того как полипептидная цепь оказывается в просвете эндоплазматической сети, соответствующая пептидаза отщепляет сигнальный пептид. Фермент узнает точку расщепления в составе специфической N-концевой последовательности белка.
II.18. МЕМБРАННЫЕ БЕЛКИ
Начальные стадии синтеза мембранных белков похожи на таковые при синтезе растворимых белков. Однако в мембранных белках, в цепи синтезирующегося мембранного белка существует одна или несколько аминокислотных последовательностей, которые образованы из 17–26 (иногда больше) гидрофобных, то есть не имеющих полярных групп, аминокислот. Как правило, подобные гидрофобные участки по краям окружены одной или двумя основными (аргинин, лизин или гистидин) или кислотными аминокислотами, содержащими боковые кислотные группы (аспарагиновая или глютаминовая кислоты). Основные кислоты обычно расположены со стороны цитоплазмы, а кислые остатки со стороны просвета эндоплазматической сети.
Когда данная часть аминокислотной цепи оказывается внутри гидрофильного белкового канала, возникает необходимость вытолкнуть из гидрофильной зоны канала гидрофобную скрученную цепь аминокислот. Канал раскрывается и гидрофобный скрученный участок оказывается внутри липидного бислоя.
При этом синтез белка на рибосоме не останавливается. Это приводит к тому, что весь белок остается встроенным в мембрану. В некоторых белках число альфа-спиральных "заякоревающих" участков может быть от одного до нескольких. Так, например, белок, который переносит молекулу глюкозы через мембрану, имеет 12 таких гидрофобных участков. Похожим образом оказываются в просвете цистерны эндоплазматической сети проферменты лизосом, которые переносятся к лизосомам и по ходу дела от них отщепляется пропептид и они превращаются в лизосомные ферменты-гидролазы.
В этом случае аминокислотная цепь остается погруженной в мембрану и дает начало интегральному мембранному белку. В ходе белкового синтеза возможно многократное прохождение растущей цепи через мембрану и возобновление синтеза вновь при посредстве сигнального пептида. Образующийся по такому механизму мембранный белок будет иметь множество участков, погруженных в мембранный бислой.