В 2006 году Э. Файр и К. Мелло, первый и последний автор статьи, опубликованной в журнале Природа (Nature^ 1998 г., получили Нобелевскую премию в области физиологии и медицины за работы по изучению РНК-интерференции у нематоды C. elegans, опубликованные в 1998 году. Они вводили в клетки одиночные и двойные цепи РНК, комплементарные мНК одного из генов. При введение двойной цепи РНК происходило блокирование специфического, гомологичного ей по нуклеотидной последовательности, гена. РНК-интерференция обнаружена почти во всех эукариотических организмах (за исключением почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae).
Сейчас для удаления продуктов гена из клеток, выращиваемых в пробирке, используют введение в цитоплазму или непосредственно в ядро коротких одиночных или двойных молекул РНК, комплементарным, особым образом отобранным участкам мРНК, которая синтезируется основе выбранного гена. Попадание этих фрагментов ведет к тому, что двойные разделяются на одиночные цепи с помощью белковой машины РИСК, а одиночные цепи действуют непосредственно. Полученные после разделения в РИСКе или непосредственно введенные в цитоплазму цепочки РНК, содержащие 20–25 нуклеотидов, приклеиваются (интерферируют) к комплементарным зонам мРНК производной от выбранного гена (139, 191).
Одну из двух цепочек каждого фрагмента называют ведущей или «направляющей». Ведущая цепь специфически связывается с молекулой мРНК и запускает разрезание белком. Такая длина (порядка 20–21 нуклеотидов) двухцепочечных фрагментов РНК увеличивает специфичность приклеивания ведущей цепи к мРНК. Если взять коплементарный участок большей длины, то склеивание займет больше время, а если его сделать короче, то сила сцепления склеенных участков уменьшится (135).
Приклеивание приводит к тому, что зрелая мРНК не может быть использована рибосомой и после долгого стояния отделяется от нее, разрушается с концов РНК-азами, а двойной участок снова попадает в РИСК и снова наша короткая комплементарная РНК оказывается готова к тому, чтобы инактивировать следующую молекулу мРНК. Процесс идет до тех пор, пока все мРНК не будут инактивированы. Тогда короткие цепочки РНК разрушаются РНК-азами и клетка снова может синтезировать мРНК с нашего белка. То есть введение коротких интерферирующих цепей РНК дает временный эффект по блокированию синтеза выбранного белка.
Другим методом является введение в геном с помощью микроинъекции, перфорирования или инфицирования вирусом генов, содержащих комплементарные участки, которые после синтеза незрелой РНК склеиваются друг с другом, образуя шпильки с петелькой на конце (что напоминает теннисную ракетку). Эта шпилька отрезается белками типа Дайсер и нарезается на короткие фрагменты длиной 20–25 нуклеотидов и затем в цитоплазме РИСК разделяет две цепи и образует одиночную цепь, способную приклеиваться к мРНК от выбранного белка. Обычно ген либо просто вводится, либо встраивается в геном так, чтобы он мог быть активирован особым стимулятором, который вводится в среду, где растут клетки.
Не всегда можно с уверенностью предположить, успеют ли комплементарные мРНК склеиться с короткой РНК или нет, пока ее не захватит рибосома. Насколько сильно наслаиваются склеивающиеся цепи РНК зависит степень нарушения, а также от продолжительности жизни мРНК.
Если длина комплементарной склейки достигает 20 и более нуклеотидов, то прочность склейки становится значительной и склеенные участки не позволяют рибосоме передвигаться вдоль мРНК. Рибосома встает перед местом склейки и затем распадается на две субъединицы. Синтез белка останавливается. После прекращения синтеза белка рибосома распадается и мРНК содержащая склейки, или две склеенные молекулы мРНК становятся жертвами Дайсера и РИСКа. Тем самым блокируется синтез белка. Совершенно не ясно, успеет ли комплементарные мРНК склеиться или нет, пока ее не захватит рибосома. Или же рибосома встает перед местом склейки и затем распадается на две субъединицы.
II.23. НОКАУТЫ ГЕНОВ
Вторым способом, использования способности нуклеиновых кислот интерферировать в местах, где цепи нуклеотидов, комплементарных друг другу, стал метод удаления генов или их мРНК. Используется два подхода: нокаут гена и нокдаун гена. Нокаут гена (англ. gene knockout) — это метод при котором из организма удаляют или делают неработоспособными определенные гены. Для нокаута синтезируют такой же ген или его фрагмент, изменённый так, чтобы продукт гена потерял свою функцию. Для получения нокаутных мышей полученную генно-инженерную конструкцию или химерный ген вводят в эмбриональные стволовые клетки, где конструкция замещает нормальный ген, а измененные клетки имплантируют в бластоцист (ранняя стадия эмбриона)суррогатной матери. У плодовой мушки дрозофилы мутации инициируют в большой популяции, в которой затем ищут потомство с нужной мутацией. Сходным способом получают нокаут у растений и микроорганизмов.
Чтобы встроить ген в кольцевую ДНК, которая чаще всего используется для внедрения гена в клетку, применяют ферменты — рестриктазы и лигазы, также являющиеся полезным инструментом генной инженерии. С помощью рестриктаз ген и кольцевую ДНК можно разрезать на кусочки. С помощью лигаз такие кусочки можно «склеивать», соединять в иной комбинации, конструируя новый ген, а затем заключая его в ту самую кольцевую ДНК. Кольцевые ДНК, используемые для введения инородного гена в геном, часто называют векторами.
Ученые научились внедрять в клетки гены, которых у них ранее не было. Делается это обычно путем продырявливания плазматических мембран. Через дырки в цитоплазмы поступают гены в составе кольцевой ДНК. В сущности, процесс введения дополнительных генов таков же, как и при нокауте, но существующие гены не замещаются и не повреждаются.
У эукариот (клеток с ядрами) нокаут гена (разрушение здорового гена) производят путём использования феномена гомологичной рекомбинации (обмена нуклеотидными последовательностями) между сравнительно небольшим участком инородной (экзогенной) и клеточной ДНК.
Трансформированные эмбриональные стволовые клетки вносят в зародыш, и полученных химерных животных скрещивают для получения линии мышей, гомозиготных по полученной мутации.
Вектор, используемый для нокаута, несет клонированную последовательность изучаемого гена, с внесенными в нее необходимыми изменениями. Это может быть: внесение стоп-кодона, приводящее к синтезу короткого неактивного пептида; удаление одного или нескольких экзонов; делеция (удаление) промоторной (стимулирующей) области, расположенной перед самим геном; вставка, приводящая к нарушению нормального функционирования гена и любые другие изменения, приводящие к отсутствию функционального продукта изучаемого гена или значительно снижающие его активность. Также в эту последовательность вносится положительный селективный маркер, на основе которого синтезируется белок, делающий несущие его клетки устойчивыми к антибиотикам неомицину и канамицину. Модифицированная последовательность нуклеотидов должна быть окружена с обеих сторон неизмененными участками, по которым будет проходить рекомбинация (взаимообмен) с ДНК в хромосоме.
При этом существует вероятность, что рекомбинация пройдет не по исследуемым нами участкам генома, а в любой другой сходной области. Эта проблема решается внесением в векторную конструкцию маркера отрицательной селекции. Им может служить ген дифтерийного токсина А (DT-A), продукты которых убивают эукариотические клетки. Клетки, в которых взаимообмен (рекомбинация) прошел неправильно синтезируют данный токсический ген и погибают. Остаются лишь небольшое количество клеток, где рекомбинация прошла там, где надо. Как все это делается подробно описано в методических книжках. Я не буду загружать вашу память. Кто хочет, может найти эти сведения в Интернете.
Эмбриональные стволовые клетки мыши впервые получены в 1981 году, что дало возможность для развития работ по инактивации генов. Внесение нашего вектора в эмбриональные стволовые клетки возможно с помощью микроинъекции, химического (помощью липидов или других веществ) или физического (электропорация) кратковременного перфорирования плазматической мембраны, или с помощью заражения клеток вирусом, в геном которого встроен наш вектор. Наиболее экономичными и достаточно эффективными методами внесения экзогенной ДНК в клетку являются электропорация и ретровирусная инфекция. К их достоинствам, в первую очередь, следует отнести возможность одноразово обработать сотни тысяч клеток, которые благодаря системе позитивной-негативной селекции достаточно быстро проходят отбор.
После того, как линия трансформированных клеток получена и поддерживается, их вносят в эмбрион мыши (как правило, на стадии бластулы). Затем содержащий наши клетки химерный зародыш подсаживают в матку ложно беременной самки. Полученную таким образом химеру скрещивают с нормальным, но имеющим отличия (например, цвет) животным, пока не будет получена гомозиготная линия. Результатом будет получение линии животных, гомозиготных по созданной мутации. Не все гены можно инактивировать на стадии зародыша — для них существуют боле сложные генно-инженерные методы.
II.24. РОЛЬ СКЛЕИВАНИЯ (ИНТЕРФЕРЕНЦИИ) РНК
Зачем на самом деле нужны механизмы, служащие для процессинга (разрушения) малых РНК? Пока такие гены найдены только у червя (173). Думаю, что механизм по разрушению двойных цепей РНК в клетке был разработан природой для борьбы с гибридизационными осложнениями. Склеивание двух мРНК или внутримолекулярное склеивание одной мРНК может вести к блокированию синтеза белков в определенных ситуациях, когда сам белок не изменен ни на йоту. Эксперименты на червях лучше всего объясняются с этих позиций.
Гибридизационые мутации накапливаются в экзонах и интронах, которые могут в данный момент не использоваться в данной клетке. Многие гены молчат, но накапливают иммуногенные мутации, которые выявляются иммунной системой. Система РНК-интерференции играет также важную роль в защите клеток от паразитирующих генов и вирусных генов. Считается, что РНК-интерференция является защитным механизмом, предохраняющим клетку от РНК-вирусов и мобильных генетических элементов (транспозонов).