Хотя постоянная или конститутивная, а точнее сказать нерегулируемая, секреция имеет существенное значение для жизнедеятельности клеток, самую важную роль в большинстве организмов играет регулируемая секреция белков, гликозилированных белков и полисахаридов.
Суть данного процесса можно описать следующим образом. Секретируемые белки являются растворимыми немембранными белками. Долгое время считалось, что правильно свернутые (на научном жаргонизме их еще называют фолдированными белками), взаимодействуют с так называемыми рецепторами секретируемых белков. Согласно данной модели, свернутый белок прикреплялся к своему мембранному рецептору. Последний же взаимодействовал с КОП-2 покрытием и тем самым оказывался внутри КОП-2 везикул, которые затем транспортировались от эндоплазматической сеть к пластинчатому комплексу. Несмотря на насущную необходимость найти эти рецепторы для всего многообразия секретируемых белков, они так и не найдены, за исключением одного случая с дрожжах. И то остается не совсем ясным, насколько эти данные можно обобщать для всех дрожжей.
Новый взгляд на работу АГ позволяет по-другому оценить механизмы выхода секретируемых белков из эндоплазматической сети и их последующей концентрации либо в секреторных гранулах либо в пост-Гольджи структурах. Эти механизмы общие не только для белков регулируемой секреции, но и для белков секретируемых клетками печени для нужд плазмы крови без всякой регуляции.
Одни вещества непрерывно секретируются производящими их клетками, тогда как другие запасаются в секреторных пузырьках и высвобождаются только после получения клеткой соответствующего сигнала извне. Этот сигнал к секреции часто представляет собой химический медиатор, например гормон, связывающийся с рецепторами на поверхности клетки. В результате происходит активация рецепторов, которая вызывает обычно кратковременное повышение концентрации свободного кальция в цитоплазме. Последнее инициирует процесс экзоцитоза, побуждая секреторные пузырьки к слиянию с плазматической мембраной и таким образом высвобождая их содержимое во внеклеточное пространство. Мембраны секреторных пузырьков объединяются с плазматической мембраной и в дальнейшем посредством эндоцитоза возвращаются в первоначальное состояние. Общая площадь мембраны, временно включающейся в состав плазматической мембраны, может быть огромной: в ацинарной клетке поджелудочной железы в состав апикальной плазматической мембраны площадью 30 кв. мкм при стимулировании клетки к секреции включается около 900 кв. мкм мембраны секреторной гранулы.
Слияние внутриклеточных пузырьков с плазматической мембраной называется экзоцитозом. Например, для того чтобы секретировать инсулин, клетки, продуцирующие этот гормон, упаковывают его во внутриклеточные пузырьки, которые сливаются с плазматической мембраной и открываются во внеклеточное пространство, высвобождая при этом инсулин.
V.9. ТРАНСПОРТ ОТ АГ К ЭНДОСОМАМ И ЛИЗОСОМАМ
Несколько по-другому организовано концентрирование ферментов, предназначенных для доставки в лизосомы. Эти ферменты имеют особые последовательности аминокислот, к которым в момент, когда белок попадает в пластинчатый комплекс Гольджи, присоединяются небольшие цепи моносахаров, один из которых заканчивается маннозой с форфатной группой. На уровне последнего диска АГ располагаются (они здесь концентрируются с помощью особых механизмов, о которых рассказывать просто нет времени) особые рецепторы. Эти рецепторы имеют свойство приклеиваться к маннозе, связанной с фосфатной группой. Тем самым ферменты лизосом концентрируются на уровне последнего диска АГ и затем отправляются в сторону эндосом, а потом лизосом.
Модификация ферментов, функционирующих в лизосомах и способных разрезать аминокислотные цепи, происходит в АГ. Как уже указывалось выше, лизосомальные ферменты синтезируются в эндоплазматической сети и затем попадают в АГ, здесь имеются специальные ферменты, которые распознают участки лизосомальных ферментов, способные к присоединению фосфатной группировки. Формируется особая химическая группа маннозо-6-фосфат. Она очень характерна и может очень прочно прикрепляться к специальным мембранным белкам рецепторам. Существует два таких рецептора маннозо-6-фосфатных групп.
Рецепторы маннозо-6-фосфата является маркером ТГС и мембран поздних эндосом, но его нет в мембранах лизосом.
Только белки-предшественники лизосомных гидролаз имеют специфическую олигосахаридную, а именно, маннозную группу. В цис-цистернах эти группировки фосфорилируются и дальше вместе с другими белками переносятся от цистерны к цистерне, через среднюю зону в транс-участок. Мембраны ТГС содержат трансмембранный белок — рецептор (манноза-6-фосфатный рецептор или М-6-Ф-рецептор), который узнает фосфорилированные маннозные группировки олигосахаридной цепи лизосомных ферментов и связывается с ними. Это связывание происходит при нейтральных значениях рН внутри цистерн транссети. На мембранах эти М-6-Ф-рецепторные белки образуют кластеры, группы, которые концентрируются в зонах образования мембранных почек, покрытых клатрином.
Следовательно, М-6-Ф-рецепторы, являясь трансмембранными белками, связываясь с лизосомными гидролазами, отделяют их, отсортировывают, от других белков (например, секреторных, нелизосомных) и концентрируют их в окаймленных почках. Процесс очень сложно организован в пространстве и времени. После того, как лизосомальные ферменты получили свой маркер — маннозо-6-фосфатную группировку, от них отрезается небольшой участок молекулы, который предотвращает преждевременную активацию фермента. Большей частью отрезание происходит в ТГС или в эндосомах и осуществляется это особым белком фурином. После захвата готовых лизосомальных ферментов М6Ф-рецепторами, рецепторы приобретают способность взаимодействовать с клатрин-1 покрытием, встречающимся на ТГС и эндосомах. Рецептор захватывается клатрин-1 бляшками и начинается формирование мембранной почки, покрытой плотным клатрин-1 покрытием. В этом же покрытии скорее всего (и это было показано для ряда белков) концентрируются соответствующие СНАРЕ, ответственные за слияние с эндосомами. На определенном этапе, покрытие отщепляется, также скорее всего с участием динамина и актина и мембранная почка сливается с эндосомой. При этом идет разрыв ножки мембранной почки и содержимое почки оказывается уже в составе эндосом. Описаны специализированные переносчики, покрытые клатрин-1 покрытием и двигающиеся от АГ на периферии клетки. Однако это найдено на клетках с увеличенным содержанием одного из компонентов клатрин-1 покрытия. Поэтому не ясно, имеются ли такие переносчики в норме.
Переносчики, содержащие набор лизосомальных ферментов, образуются в ТГС (TGN) и перемещаются к ранним или поздним эндосомам, где встречаются с интернализованными (поглощенными клеткой) лигандами или фагоцитированным материалом. Таким образом, формируются структуры, которые иногда обозначаются как поздние эндосомы.
При слиянии первичной лизосомы с эндоцитозной вакуолью происходит диссоциация комплексов М-6-Ф-рецептор-гидролаза, из-за кислой среды внутри вторичной лизосомы. Затем уже свободный фермент после потери фосфатной группы активируется и вступает в работу. Освободившиеся мембранные рецепторы переходят в мелкие пузырьки, отщепляющиеся от вторичной лизосомы, и уходят снова в транс-участок аппарата Гольджи, т. е. происходит их рециклизация.
Как уже говорилось, внутри эндосом из-за активности протонного переносчика происходит закисление среды. Начиная с рН 6 лизосомные ферменты диссоциируют от М-6-Ф-рецепторов, активируются и начинают работать в полости эндолизосомы. Участки же мембран вместе с М-6-Ф-рецепторами возвращаются путем рециклизации мембранных пузырьков обратно в ТГС.
При ознакомлении с работой лизосом, всегда возникает вопрос, почему же эти мембранные образования не переваривают сами себя? Мембранные компоненты лизосом очень устойчивы к гидролазам, содержащимся внутри лизосомных пузырьков. Мембраны лизосом уникальны. Оптимум рН для функционирования большинства лизосомных гидролаз близок к 5, поэтому клетка встраивает в лизосомные мембраны огромное количество протонных насосов (Н+ обменников), которые закисляют среду в поздних эндосомах и особенно в лизосомах. Мембраны лизосом отличает очень высокий уровень гликозилирования специфических гликопротеинов мембран лизосом. Эти белки типа ЛАМП или ЛГП (lamp и lgps) имеют специальные сигналы, которые позволяют им очень долго находиться в просвете АГ. Такое поведение ведет к тому, что полисахаридные цепочки у них становятся очень длинными и резко разветвленными с обилием молекул сиалиловой кислоты и фукозы на концах полисахаридных цепей.
При высоком содержании протонов в среде такие полисахариды образуют олигомеры, которые надежно предупреждают проникновение лизосомальных гидролаз к стенке лизосом и тем самым предохраняют стенку от повреждения. Мембранные элементы лизосом защищены от действия кислых гидролаз олигосахаридными участками, которые или не узнаются лизосомными ферментами, либо просто мешают гидролазам взаимодействовать с ними. Если бы этого не было, то при повреждении стенки лизосомальные гидролазы выходили бы в цитоплазму и вызывали самопереваривание клетки. Такие ситуации случаются в патологии.
Наконец, созревшие (модифицированные) белки переносятся в различные отделы клетки, такие, как лизосомы, цитоплазматическая мембрана или секреторные пузырьки. Последние высвобождают свое содержимое к межклеточное пространство, сливаясь с плазматической мембраной (экзоцитоз). Эти транспортные процессы могут проходить постоянно, или регуляторными, т. е. управляться химическими сигналами.
Прибытие переносчика к плазматической мембране не всегда сопровождается его полным слиянием с ней и встраиванием мембраны переносчика в плазматическую мембрану. Возможен вариант, когда после слияния переносчик опорожняет свое содержимое во внешнюю среду через образовавшуюся пору, а вот интеграции его мембраны в плазматическую мембрану не происходит. Вместо этого переносчик отщепляется от плазматической мембраны, теряя с ней непрерывность. Такой механизм соответствует модели поцеловал-и-убежал (кисс-анд-ран, kiss-and-run) (177). Также совсем недавно было доказано, что механизм транспорта по типу "поцеловал-убежал" имеется и при транспорте между меланосомами и эндосомами (147).