Видимые исследователю мутации ― это такие, которые существенно изменяют функцию активных, консервативных в эволюции участков цепочки аминокислот в белке, осуществляющих сам процесс присоединения одного белка к другому на основе электростатических сил, или непосредственно участвующих в переносе электронов между участком белка и присоединенным органическим субстратом, то есть выполняют каталитическую функцию. В этом случае изменение последовательности аминокислот или трёхмерной организации данного участка, или его окружения ведёт к существенному (то есть, регистрируемому) нарушению функции белка. Именно поэтому такие участки (назовём их функциональными) белка являются наиболее неизменяемыми в эволюции. Другие участки, которые вносят меньший вклад в функцию белка, сильно варьируют между собой внутри разных видов живых существ. Однако варьируют всё же в определённых пределах, таких, чтобы это не затронуло функцию основного участка белка.
В большинстве этих изменений замена одной аминокислоты не влияет на функцию белка и не регистрируется. Например, замена аминокислот гомологичными им в неконсервативных участках белка практически не имеет видимого проявления на уровне фенотипа.
Тем самым, эти другие мутации (те, которые вызывают замену аминокислот аминокислотами, очень сходными по химическому строению, или меняют аминокислоты белка, которые не имеют существенного функционального значения) просто невидимы генетику. Поэтому назовём такие мутации невидимыми мутациями. Однако такие невидимые мутации не остаются бесследными. Хотя они не влияют значительно на функцию белка, тем не менее, они всё же оказывают влияние на процессы в клетке, особенно те, что так или иначе связаны с данным белком. Однако несколько невидимых мутаций в разных белках могут иметь кумулятивный эффект. В научной литературе часто встречающиеся в популяциях варианты последовательностей генов, не приводящие к заметным нарушениям функций, обычно рассматриваются как нейтральные мутации или полиморфизмы, тогда как понятия "мутация" и "мутантный аллель" зачастую употребляются как синонимы.
Мутации нарушают функцию белков, только если они затрагивают главные их центры, те участки, которые определяют главную функцию белков. Поэтому "многобелковые" признаки, то есть зависящие от функции многих белков, не передаются по наследству согласно правилам Менделя, поэтому нет благоприобретения признака отсутствия хвоста ж опытах Вейсмана или препуциума у мужчин-евреев. Значимые, видимые мутации дают симптомо-комплекс, если мутации в нефункциональной части или замена аминокислотой гомологичной, то возникают невидимые мутации.
Только некоторые высококонсервативные аминокислоты в тех частях белка, которые выполняют главные функции, будут давать изменение этой функции и только определенные замены, а не все дадут серьезные нарушения. Самое интересное, что если просто выбить белок, то из-за огромного резервирования функций, опять можно вообще ничего не увидеть. Например, у человека имеется 4 гена, кодирующих первый коллаген. Причем, как правило, молекулы мРНК синтезируются в избытке. Поэтому если выбить один ген, то будет достаточно и одного. Более того, кроме первого коллагена имеется еще с десяток других коллагенов с перекрывающимися функциями и они могут возместить функцию 25 % не хватающих молекул первого коллагена.
Итак, из огромного числа возможных мутаций, если считать мутацией изменение последовательности нуклеотидов, только ничтожно малая часть будет отражаться на фенотипе, то есть внешних и внутренних признаках полученного организма. Одни мутации летальны, и они не могут передаваться следующему поколению, а другие не столь опасны и сохраняются в потомстве.
Если мутации происходят в геноме клеток зародышевой линии человека, все соматические клетки организма-потомка, который развивается из мутантной зиготы, образовавшейся от слияния мутантных гамет, будут содержать эту мутацию. Чем позже в онтогенезе возникает соматическая мутация, тем меньше размер клона мутантных клеток во взрослом организме. Мутации в соматических клетках, возможно, вызывают процессы старения, рак и другие, менее существенные изменения в организме. Если мутация произошла в половых клетках, или при образовании половой клетки, то она может отразиться только на фенотипе последующих поколений ― мутация передается по наследству. Мутации в половых клетках родителей наследуются детьми.
Обычно считается, что такие мутации происходят совершенно случайно. Так возникает изменчивость, служащая материалом для естественного отбора. Но мутации могут происходить при делении любых клеток тела, а не только при образовании яйцеклеток и сперматозоидов. Такие мутации называются соматическими (от "сома" ― тело) и приводят к возникновению участков измененных тканей. Соматические мутации могут быть вызваны различными воздействиями внешней среды. Классическая генетика отрицает возможность наследования соматических мутаций. Считается, что изменения клеток тела (в том числе и мутации) не могут отразиться на генах половых клеток (68).
Мутации тоже удобно рассматривать на модели компьютерной бумажной перфоленты. Итак, хотя перфолента и сделана из прочной бумаги, то, тем не менее, она легко повреждается. Если будет разорвана перемычка между дырками, то белковая машинка, синтезирующая или ремонтирующая ДНК не заметит разницы меду 2 и 3 дырками и тогда вместо оригинальных 3 дырок на комплементарной ленте будет пробиты только две. К чему это приведет? К тому, что на перфоленте мРНК будет другой триплет.
На магнитной ленте уже будет другой кусочек магнитного пластика.
6.7. КАК ОБНАРУЖИВАЮТСЯ МУТАЦИИ
Чтобы понять, почему имеются расхождения в оценке скорости мутаций, надо иметь представление о том, как мутации обнаруживаются. О наличии тех или иных аллелей часто судят на основании анализа аминокислотной последовательности соответствующих белков. Но такой анализ очень дорог и конечно, пока никто не сравнивал по аминокислотной последовательности хотя бы два аллельных гена у одного и того же человека.
Вообще же поиск неизвестных мутаций и выявление известных мутаций ― это разные диагностические задачи. Крупные неизвестные мутации обнаружить легче. Для выявления точечных мутаций нужны методы с более высоким разрешением. Для выявления неизвестных мутаций лучше всего подходят следующие методы: электрофорез (то есть, разгонка белков под действием слабого электрического тока) в денатурирующем градиентном геле, модификация карбодиимидом, химическое или ферментативное расщепление некомплементарных сайтов, анализ конформационного полиморфизма (определение того, как она скручена) одноцепочечной ДНК, гетеродуплексный (на предмет поиска неоднородных особых последовательностей нуклеотидов) анализ и наконец, определение полной нуклеотидной последовательности данной ДНК.
Для анализа мутантных генов-аллелей, прежде всего, необходимо иметь изолированные последовательности мутантного гена, которые могут быть получены либо путем клонирования или амплификации (встраивают ДНК в кольцевидную ДНК (плазмиду), затем плазмиду встраивают в бактерию и выращивают бактерии, а затем ДНК изолируют из бактерий) мутантной ДНК или ее частей.
На практике чаще проводят предварительный отбор более простыми методами, а иногда клонированных фрагментов ДНК, предположительно содержащих мутации, а затем секвенируют (определяют последовательность нуклетидов) только эти участки ДНК.
Для поиска мутаций при анализе мРНК и ДНК в пробирках широко используются короткие цепи РНК. Например, гибридизация в "блотах", то есть в отдельных скоплениях белков после разгонки смеси белков в электрическом поле. С помощью гибридизации можно выделить мРНК данного белка и провести ее анализ на предмет последовательности нуклеотидов.
Любые типы мутаций могут быть обнаружены путем прямого секвенирования (то есть определения последовательности нуклеотидов) мутантной ДНК или отдельных экзонов. Обнаружение нарушений в первичной нуклеотидной последовательности ДНК, является самым точным методом молекулярной диагностики наследственных заболеваний. Для этого проводится сложнейшая процедура разбивания ДНК на отдельные фрагменты, а потом компьютер, наслаивая концы фрагментов друг на друга и сопоставляя полученную цепь с количеством того или иного нуклеотида, позволяет составить всю цепь нуклеотидов. Но это довольно дорогая процедура. Для некоторых генов, имеющих небольшие размеры, метод прямого секвенирования (расшифровка последовательности нуклеотидов) с успехом применяется как основной метод поиска мутаций. Так, в частности, особенно удобным оказалось его применение для поиска мутаций в сравнительно небольших по размеру генах, таких, например, как ген фактора IX свертывания крови (гемофилия В).
На деле, если нет фенотипа, то никто искать мутации не будет. Приведу знакомый мне пример выявление мутаций, пример того, как была найдена мутация в одном из белков, образующих рассмотренный выше коатомерный комплекс белков. Исследователи задались целью найти все те мутации, которые ведут к уменьшению числе белков-рецепторов так называемых липопротеидов низкой плотности (тех которые переносят в плазме крови холестерин (правильнее холестерол) на плазматической мембране. Для этого стандартные клетки, культивируемые в большинстве лабораторий мира подвергали определенным воздействиям, которые резко увеличивали скорость возникновения мутаций. Увеличив мутагенез, ученые регистрировали такой признак, как уменьшение доставки нашего белка-рецептора на плазматическую мембрану. В результате ими был обнаружен клон клеток, который при чуть пониженной температуре мог расти, а при нормальной температуре человека погибал, обнаруживая странные изменения аппарата Гольджи. Генетический анализ показал, что в эта-субъединице коатомера заменена одна аминокислота (161). Если повреждались другие субъединицы коатомера, то клетки просто-напросто гибли (223).
В целом молекулярная биология разработала эффективные методы для работы с генетическим материалом. Методы определения последовательности нуклеотидов довольно разработаны и требуют для своего описания многих и многих страниц, но они мало что дают для обоснования основной мысли данной книги и я их для краткости опускаю.