2 (рис. 3).
Рис. 3. Восстановление флавинадениндинуклеотида (показана флавиновая часть молекулы ФАД)
Рассмотрим некоторые важные ферменты, в состав которых входит железо.
Каталазы. Ферменты, относящиеся к этой группе, разлагают пероксид водорода на воду и кислород. Широкая распространенность и большая активность, о которой мы упоминали, позволяют обнаружить фермент в различных животных и растительных тканях простейшими средствами.
Достаточно бросить в аптечный раствор пероксида водорода кусочек моркови, картофеля, мяса, как сейчас же будет заметно энергичное выделение пузырьков газа (кислорода) на их поверхности: это действует каталаза. Под влиянием пероксида водорода фермент и сам медленно разлагается, но в слабых растворах (а в клетках концентрация пероксида невелика) каталаза работает долго и энергично, устраняя опасности, связанные для организма с действием такого сильного оксислителя, каким является пероксид[2].
Хотя наблюдения подобного рода делались давно, чистую кристаллическую каталазу удалось получить лишь в 1937 г. Молекулярные массы каталаз различного происхождения лежат в пределах 225000-250000; на одну белковую молекулу приходится четыре иона железа.
В процессе взаимодействия каталазы с пероксидом образуется неустойчивое промежуточное соединение зеленого цвета. Именно оно и служит тем важным звеном, которое определяет весь ход каталитического разложения пероксида.
При больших концентрациях пероксида (по Чансу) каталаза образует с пероксидом еще два соединения — одно из них, красного цвета, слабоактивно, а другое вовсе не обладает каталитической активностью.
Промежуточное зеленое соединение реагирует со второй молекулой пероксида по схеме:
Каталитическое разложение пероксида
Ион железа в каталазе находится в степени окисления +2 (см. гл. 7).
В последнее время получены данные, указывающие, что каталаза способна ускорять не только разложение пероксидов, но и другие реакции, например окисление спиртов.
Пероксидаза. Функция фермента пероксидазы заключается в том, что она ускоряет окисление различных веществ (доноров водорода) пероксидом водорода. Первые наблюдения над действием пероксидазы относятся еще к 1855 г. (Шенбейн), но тщательное изучение ее природы и свойств началось только в 30-х гг. нашего века.
Пероксидаза — это белковый комплекс, причем ион железа в нем находится в степени окисления +3. Так же как и в других порфириновых белковых комплексах, пятое место в координационной сфере железа занято белком, а шестое свободно и является реакционным пространством комплекса — к нему присоединяются те группы, которые участвуют в катализе.
Молекулярная масса пероксидазы относительно невелика и составляет 40000. Пероксидаза окрашена в коричневый цвет, в ее белковой части содержится также и углевод (уроновая кислота).
Чанс, исследовавший механизм действия пероксидазы, выделенный из корня хрена (в этом растении содержание пероксидазы особенно велико), пришел к выводу, что фермент образует с пероксидом водорода три соединения, проявляя в этом отношении некоторое сходство с каталазой. Одно из этих соединений зеленое и два — красных. Зеленое очень непрочно и легко переходит в одно из красных (другое получается при большом избытке пероксида). Реакция окисления соединения (например, аскорбиновой кислоты), которое мы условно обозначим АН2, заключается в отнятии от АН2 водорода, соединяющегося с кислородом пероксида. Схема реакции с участием пероксидазы, которую мы обозначим Пер -ОН, такова:
Схема реакции с участием пероксидазы
Некоторые исследователи считают, что в пероксидазе во время этой реакции железо переходит в высшие степени окисления (+4), но окончательно этот вопрос еще нельзя признать решенным.
Модели ферментов. Большой интерес вызывает вопрос о возможности создания катализаторов, менее сложных по составу, чем ферменты, но вместе с тем столь же активных и избирательно действующих. Речь, следовательно, идет о получении моделей ферментов на основе сравнительно простых систем. Еще в начале XX в. Г. Бредиг обнаружил, что мелкораздробленные металлы (например, платина) проявляют способность сильно ускорять некоторые реакции, в частности разложение пероксида водорода. Такие "металлические модели", конечно, мало походили на белковые катализаторы, но все же стало ясно, что высокая каталитическая активность не является свойством, присущим только ферментам.
В 50-х г. Л. А. Николаев исследовал "медные модели" фермента каталазы, состоящие из комплексных соединений меди, и доказал, что ион меди, окруженный молекулами аммиака или аминогруппами, например в комплексах:
Ион меди, окруженный молекулами аммиака или аминогруппами
проявляет очень большую каталитическую активность в реакции разложения пероксида водорода. Позже были изучены реакции гидролиза (Р. Густавсон и С. Чибрик), ряд окислительных реакций (А. П. Пурмаль и др.), исследован механизм процессов катализа (А. П. Пурмаль, А. Я. Сычев и др.) и установлено, что многие комплексные соединения металлов вполне могут рассматриваться как модели активных групп металлосодержащих ферментов.
В настоящее время ведутся работы по изучению сочетаний комплекс металла — высокомолекулярный носитель; такая система уже совсем близка к природным ферментам. С другой стороны, фиксируя природный фермент на носителе, например на силикагеле, в приборе, называемом хроматографической колонкой, можно повысить его устойчивость и сделать более удобным использование фермента в производственных условиях. Такие "иммобилизованные" ферменты (т. е. зафиксированные на носителе) находят все большее применение в технологии производства пищевых продуктов.
Глава 5. Активаторы и киназы
Мы переходим теперь к тем случаям участия металлов в действии ферментов, когда ион металла, не образуя прочных комплексов, тем не менее сильно повышает активность фермента, иначе говоря, играет роль активатора.
Ион металла, белок фермента и превращаемая молекула того или иного соединения (субстрат) в процессе реакции образуют различные промежуточные структуры. На рисунке 4 показаны возможные сочетания иона металла (М), субстрата и белка-фермента (Ф). Субстрат играет роль лиганда и обозначен L.
Рис. 4. Возможные сочетания белка (L), иона металла (М) и фермента (Ф)
Ион металла может действовать на лиганд, уже соединенный с белком, может располагаться между ними ("мостик"), может вступать в соединение с другой точкой белковой молекулы. При этом ион металла выполняет в общем случае сразу несколько функций: он поддерживает лиганд (субстрат) и белок в определенном пространственном положении, удобном для реакции, оказывает на связанные с ним молекулы или группы атомов поляризующее действие, смещая в них электроны, и, наконец, он может действовать как катализатор. Различить эти отдельные функции в общем эффекте повышения активности фермента очень трудно, и чаще всего механизм работы активаторов остается спорным.
Доказано, что ионы металлов делают более устойчивой ту форму белковой молекулы фермента (ее активной области), которая проявляет наибольшую каталитическую активность.
Важным ферментом, содержащим ион металла, а именно цинка, является карбоксипептидаза. Карбоксипептидаза вместе с другими ферментами, катализирующими гидролиз, разлагает молекулу пищевого белка на отдельные аминокислоты, из которых потом клетка построит нужные ей белки. Специальность карбоксипептидазы — отщепление аминокислотных остатков от того конца полипептидной цепочки белка, на котором находится карбоксильная группа, например:
Специальность карбоксипептидазы — отщепление аминокислотных остатков от того конца полипептидной цепочки белка, на котором находится карбоксильная группа
R обозначает какой-нибудь радикал, например СН3. Под влиянием карбоксипептидазы произошло отщепление концевой аминокислоты (в данном случае глицина); к концам разорванной связи присоединились ионы Н+ и ОН- молекул воды, как это вообще происходит при гидролизе пептидных связей NH-СО.
Молекулярная масса карбоксипептидазы 87000; молекула ее состоит из трех субъединиц и включает 307 аминокислотных остатков. Молекула имеет шаровидную форму, на ее поверхности недалеко от иона цинка обнаружены углубления и канал, по-видимому, содержащие молекулы воды и предназначенные для правильного размещения той части белковой цепочки, на которую действует фермент. Активный центр этого фермента построен довольно сложно и содержит большое число аминокислотных остатков, положение которых в настоящее время известно достаточно точно. Ион цинка связан с двумя остатками гистидина и глутаминовой кислоты (рис. 5).
Рис. 5. Строение активного центра фермента карбоксипептидазы (расстояния между атомами даны в нанометрах)
Цинк удается заместить на ионы других металлов: кобальт(II), марганец(II), никель(II), причем получаются активные карбоксипептидазы. Относительная легкость такой замены и образование активных соединений с другими ионами — характерный признак многих случаев активации; здесь специфичность металла менее выражена, чем, например, в гемовых комплексах.
Все эти ионы способствуют связыванию субстрата (т. е. полипептидных белковых цепей) с активными центрами, кроме того, ион металла оттягивает на себя электроны кислорода карбонильной группы С=O (в пептидной связке СО-NH), в результате чего двойная связь между С и О поляризуется и облегчается ее реакция с водой, приводящая к разрыву С-N связи:
Ион металла оттягивает на себя электроны кислорода карбонильной группы С=O
(волнистая линия — полимерная молекула белка).
Ионы цинка, как мы уже упоминали, входят в состав еще одного фермента, функции которого тесно связаны с дыханием, — карбонангидразы. Этот фермент был выделен из эритроцитов человека и животных и оказался белковым соединением с молекулярной массой около 30000. На одну молекулу фермента приходится один атом цинка. В зависимости от источника получения молекулярная масса несколько колеблется, поэтому считают, что существует несколько видов карбонангидразы (изоферменты).