жду прочим, до сих пор живы.
Одна из самых романтичных и обольстительных первых строчек среди всех стихотворных текстов, когда-либо написанных по-английски: «Had we but world enough and time» (Когда бы времени хватило нам и мира)
(Эндрю Марвелл, «К стыдливой возлюбленной»)
Рис. 17.2. Читайте только то, что выделено жирным и подчеркнуто.
В любой длинной последовательности случайных букв всегда обнаружатся еще и комбинации, из которых, опять-таки, чисто случайно складываются слова. Если при ухаживании (интересно, в наши дни кто-нибудь еще ухаживает?) вы по ошибке произнесете именно эти слова, вы можете разрушить свой единственный шанс обрести счастье. Рисунок 17.3 покажет вам, как это может произойти.
При выборе определенной комбинации правильных и неправильных слов вы явно выразите совсем другое чувство: «Had we but had enough to drink» («Когда б хватило нам хмельного здесь напитка»).
Рис. 17.3. Нет! Комбинация неудачная!
Используя этот несколько причудливый пример, можно лучше понять некоторые чисто механистические проблемы, с которыми сталкиваются наши клетки, пытаясь должным образом провести сплайсинг молекул РНК. Если бы мы сами разрабатывали такой процесс, он бы, наверное, состоял из компонентов, показанных на рис. 17.43. Но компоненты, представленные на схеме, дают лишь упрощенную картину. Важно осознавать, что различные клетки будут по-разному обращаться с одним и тем же геном — в зависимости от типа клетки и от того, что происходит с ней в данный момент. А значит, все стадии процесса нужно соответствующим образом регулировать и интегрировать, чтобы вырабатывать именно такие вариации белков, которые лучше всего подходят к конкретной ситуации (то есть лучше всего удовлетворяют нуждам организма в данный момент).
Рис. 17.4.Сверху вниз: последовательность действий, которые должна уметь выполнять сплайсинговая аппаратура клетки, чтобы соединить все нужные участки, кодирующие аминокислоты, в зрелую РНК требуемого строения и состава.
Сплайсинг как образ жизни
Такой сплайсинг длинных РНК с целью создания более коротких информационных РНК, несущих в себе сведения об определенных белках, является по-настоящему комплексным процессом. Система эта очень древняя. Ее компоненты и стадии сохраняются практически неизменными на всем протяжении эволюции — от дрожжей до царства животных. Работу проводит гигантский конгломерат молекул, который называется сплайсосомой и который как раз и представляет собой аппаратуру для сплайсинга. Сплайсосома состоит из сотен белков, а также некоторых мусорных РНК. Чем-то это напоминает рибосомы, действующие как фабрики по производству белков4.
Одна из определяющих стадий процесса — обвивание сплайсосомы вокруг промежуточных последовательностей, которые требуется удалить из молекулы РНК. Сплайсосома вытесняет их и затем объединяет участки, кодирующие аминокислоты. Это чудовищно сложный многостадийный процесс. Мы знаем, что один из его первых ключевых этапов — распознавание промежуточных областей сплайсосомой. Ей ведь явно приходится начинать именно с этого, чтобы затем соединиться с ними и удалить их.
Начала и концы промежуточных последовательностей всегда отмечены определенными элементами из 2 нуклеотидных оснований. Молекулы мусорной РНК сплайсосомы могут соединяться с этими двухосновными последовательностями. Во многом это похоже на то, как две нити ДНК соединяются в наших генах с помощью пар таких же нуклеотидных оснований.
Однако в РНК (как и в ДНК) лишь 4 разных нуклеотидных основания, а значит, возможно лишь 16 комбинаций из двух оснований (АЦ и ЦА, как и все подобные симметричные сочетания, считаются разными парами). Следовало бы ожидать, что двухосновные элементы, обозначающие начала и концы промежуточных областей, будут представлены и в других местах этих областей, а также в участках, кодирующих аминокислоты. Так и есть. Поэтому, хотя эти двухосновные последовательности необходимы для сплайсинга, их наличия еще недостаточно для того, чтобы направлять процесс должным образом. Требуются и другие последовательности (см. рис. 17.5).
Последовательности, влияющие на выбор того, как будет осуществляться сплайсинг, находятся и в промежуточных мусорных областях, и в участках, кодирующих аминокислоты. Одни влияют на сплайсинг очень сильно, другие гораздо слабее и тоньше. Одни повышают вероятность акта сплайсинга, другие понижают его. Все они работают в системах комплексного партнерства. Суммарное воздействие, которое они оказывают на окончательную картину сплайсинга, определяется и другими событиями, происходящими в клетке, и ее свойствами в данный момент, например, конкретным составом белков в сплайсосоме. Эти модифицирующие последовательности обычно описываются с применением эпитетов типа «головокружительный» или «ошеломляющий». В речи энтузиастов науки они часто означают «невероятно сложный и запутанный, в данный момент далеко превышающий возможности нашего скромного разума или даже прогностических компьютерных алгоритмов, созданных специально для таких случаев».
Рис. 17.5. Множество различных нуклеотидных последовательностей взаимодействуют в молекуле РНК, направляя сплайсинг в нужном направлении. Отмеченные буквами мотивы, состоящие из двух оснований, необходимы, но сами по себе недостаточны для того, чтобы регулировать всю тонкую настройку процесса. В ней участвуют и другие сайты, оказывающие влияние различной силы, что показано отличиями в толщине и длине стрелок.
Сплайсинг и болезни
Чтобы хоть как-то ощутить, представить степень этой сложности, рассмотрим одну группу генетических заболеваний. В их числе — форма слепоты, именуемая пигментным ретинитом и затрагивающая примерно одного человека из каждых 4 тысяч. Как правило, все начинается в подростковые годы, с ухудшения ночного зрения. С годами зрение быстро падает. Это происходит оттого, что постепенно отмирают клетки глаза, воспринимающие свет5. В среднем 1 из 12 случаев обусловлен мутацией в каком-то из 5 белков, участвующих в определенной стадии сплайсинга6,7,8,9. Данная мутация вызывает нехватку лишь клеток сетчатки, а не других клеток организма, которые также полагаются на процесс сплайсинга. Это показывает, что процессы контроля сплайсинга обладают высокой специфичностью по отношению к клеткам и генам. Пока механизмы, лежащие в основе этой специфичности, нам не понятны.
Врачам известна весьма острая форма карликовости, при которой носителю отклонения свойственны и другие не совсем обычные характеристики и особенности — слишком сухая кожа, слишком редкие волосы, склонность к припадкам, затруднения при обучении. Дети с таким заболеванием почти всегда умирают, не дожив до 4 лет10. Оно является весьма редким практически везде, кроме общины амишей штата Огайо: 8% членов общины — носители этой болезни. Дело в том, что мутация, вызывающая данное заболевание, имелась у того небольшого количества семейств, которое и основало когда-то общину. Эту болезнь не обнаруживают в других группах амишей (скажем, в Пенсильвании), основанных другими семьями. Когда удалось выявить мутацию, вызывающую это заболевание, исследователи сначала решили, что она изменяет нуклеотидную последовательность гена, кодирующего какой-то белок, который образуется в результате сплайсинга. Однако теперь известно, что на самом деле это изменение нарушает трехмерную структуру той мусорной ДНК, которая образует часть сплайсосомы11. В отличие от ситуации с пигментным ретинитом, такой дефект в функционировании сплайсосомы вызывает весьма широкий диапазон симптомов. Вероятно, при этом происходит ошибочный сплайсинг множества различных генов.
Заболевания у человека происходят не только из-за неполадок в аппаратуре сплайсинга. Недуги могут возникать и из-за того, что сами гены, кодирующие белки, обладают мутациями в местах (сайтах), которые играют важную роль при контролировании сплайсинга РНК данного конкретного гена. Некоторые ученые настаивают, что до 10% наследственных болезней человека обусловлены мутациями в этих сплайсинговых сайтах (такие сайты показаны на рис. 17.5 как последовательности из двух нуклеотидных оснований)12.
Вот пример действия такого механизма. В одной семье у двух младенцев возникла неизлечимая диарея уже в первые дни после рождения. Медперсоналу как-то удалось стабилизировать ситуацию, но диарея продолжалась много месяцев, и один из детей умер в семнадцати месячном возрасте. Когда геномы детей секвенировали, обнаружилась мутация в сплайсинговом сайте гена, меняющая одну из ГУ-последовательностей, показанных на рис. 17.5. В результате клеточная сплайсинговая аппаратура без необходимости «пропускала» один из участков, кодирующих аминокислоты. По сути, этот участок просто исключался из процесса синтеза белка, и получающийся белок больше не мог выполнять свою работу13.
Саркома Капоши — форма рака, которая впервые привлекла внимание общественности, когда обнаружилось, что она широко распространена среди больных СПИДом. СПИД вызывется вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) — (HIV, the human immunodeficiency virus). Инфицирование этим вирусом приводит к подавлению иммунной системы. Саркому Капоши вызывает другой вирус. Он получил название HHV-8. Обычно наша иммунная система держит этот вирус под контролем, но если ее функционирование серьезно нарушено, HHV-8 может утвердиться в организме и спровоцировать саркому Капоши.
Вирус HHV-8 широко распространен среди жителей Средиземноморья, однако у них редки случаи саркомы Капоши, а у маленьких детей ее почти никогда не обнаруживали. Поэтому медики очень удивились, когда одна турецкая семья привела врачам двухлетнюю дочку, на губе у которой имелись образования, характерные для данной разновидности рака. Они быстро и агрессивно росли, и девочка умерла всего спустя 4 месяца после того, как ей впервые поставили диагноз.