Контаминация не пустая угроза. Контаминация может принимать самые разные формы, и она сыграла немалую роль в формировании облика исследований древней ДНК. Первые и единственные участки ДНК динозавров, о которых сообщали исследователи, были (не стоит падать в обморок) результатом контаминации. Многие из них оказались участками человеческой ДНК. Поскольку никто не поверил, что динозавры состояли в более близком родстве с млекопитающими, нежели с птицами или рептилиями, и почти никто не поверил, что ДНК может сохраниться в настолько древних останках динозавров (представлявших собой в большей степени камни, нежели кости), этот результат отклонили, поскольку он определенно был вызван контаминацией.
Однако зачастую контаминация менее очевидна, и именно в таких случаях она представляет наибольшую опасность. ДНК современных голубей (тех самых сизых птиц, которые питаются фастфудом и брошенными окурками в городах по всему миру) каким-то образом попала в мой самый первый проект по исследованию древней ДНК, целью которого было секвенирование митохондриальной ДНК дронта (разновидность ДНК, наследуемая только по материнской линии (рис. 7). Как я уже упоминала, дронты относятся к семейству голубиных, и мне повезло, что я обнаружила контаминацию до того, как села писать выводы. В этом случае заметить ее было довольно просто. В то время как в большинстве моих экспериментов вообще не удавалось выделить ДНК, в этом конкретном эксперименте удалось получить огромное количество ДНК очень высокого качества. Это было явным признаком того, что результат ненастоящий. Я до сих пор не уверена, откуда взялась тогда сторонняя ДНК, но после того случая стала снимать обувь перед входом в лабораторию, а не просто надевать бахилы.
Рис. 7. Два источника ДНК в наших клетках. У людей, как и у всех прочих животных-эукариотов, каждая клетка содержит геном двух типов. Ядерный геном, включающий как аутосомы, так и половые хромосомы, находится в ядре клетки. Митохондриальный геном содержится в митохондриях – органеллах, плавающих в цитоплазме клетки. У большинства животных-эукариотов митохондрии наследуются только по материнской линии
Мой опыт и опыт множества моих друзей и коллег показывает, что существуют определенные контаминанты, которые неожиданно обнаруживаются время от времени, независимо от того, насколько чисто в лаборатории. Очень часто встречаются контаминантные цепочки ДНК домашних животных и домовых мышей. Возможно, причина заключается в том, что большинство наших экспериментов направлены на амплификацию ДНК млекопитающих, к которым, разумеется, относятся эти животные. Мы научились уживаться с контаминацией, рассчитывать на нее и искать ее. Из-за контаминации мы, ученые, изучающие древнюю ДНК, развили здоровую осторожность в отношении своих собственных данных и разработали высокие стандарты подтверждения подлинности результатов.
Надеюсь, это поясняет, почему мы надеваем такие сложные костюмы всякий раз, когда заходим в лабораторию исследования древней ДНК. Мы не защищаем себя от генетической угрозы, которая может таиться в окаменелостях. Напротив, мы защищаем ДНК, которая могла сохраниться в этих ископаемых остатках, от самих себя.
Разумеется, как бы тщательно мы ни старались избежать контаминации мамонтовых костей высококачественной ДНК, источником которой можем стать мы сами или что угодно еще, скорее всего, нам никогда не удастся найти кость, содержащую только ДНК мамонта. В самом деле, большая часть ДНК, выделенной из случайно взятой кости мамонта, будет принадлежать микроорганизмам. Что подводит нас к следующей проблеме.
Удивительное разнообразие ДНК в окаменелостях
Предположим, мы нашли в Сибири кость мамонта и хотим выделить из нее ДНК, чтобы секвенировать его геном. Для начала мы должны защитить кость от контаминации. Это значит, нам нельзя даже прикоснуться к ней голыми руками, потому что ДНК с наших рук попадет на кость и частично проникнет в ее поверхностные слои. Нам также нельзя дышать на эту кость, помещать ее в нестерильный пакет или позволять другим костям соприкасаться с ней. Итак, мы надеваем перчатки, маски и сетчатые шапочки для волос и храним каждый образец отдельно от других. Когда мы отделяем от образца кусочек, чтобы отправить его в лабораторию (ил. 5), то используем стерильные инструменты, работаем на стерильных поверхностях и после каждого образца обрабатываем все это хлорной известью.
По возвращении в лабораторию после полевых работ мы не достаем образец из стерильного пакета, пока не попадем в лабораторию. Там, облаченные в наши стильные и стерильные одежды исследователей древней ДНК, мы дробим кость в порошок с помощью стерильных дробящих инструментов и выделяем из этого порошка ДНК, используя стерильные растворы и стерильное лабораторное оборудование. По окончании выделения ДНК обломок мамонтовой кости уменьшается до размеров содержимого крошечной прозрачной пробирки: в ней содержится еще меньшее количество жидкости, на вид неотличимой от воды. В этой жидкости должна находиться ДНК мамонта.
А также ДНК бактерий.
А также ДНК грибов.
А также ДНК насекомых, растений, мышей, собак, людей и других живых существ.
Однако эти участки не мамонтовой ДНК не являются контаминантными. Точнее, это не контаминанты в том смысле, в каком таковым считалась бы моя ДНК, найденная в образце. Обнаруженные в нашей выжимке фрагменты ДНК, не принадлежащие мамонту, вероятнее всего, попали внутрь кости до того, как мы ее откопали, – где-то между моментом смерти мамонта и обнаружением его кости в земле. Бактерии, живущие в почве, грибы, насекомые и растения – все это организмы, которые заселяют кость и растут вокруг нее, пока она разлагается в земле. Вода, просачивающаяся сквозь почву, также несет с собой ДНК, которая попадет внутрь нашей кости. Даже моча содержит в себе ДНК. Несколько лет назад мы доказали, что ДНК овец можно обнаружить в Новой Зеландии в тех же слоях почвы, в которых в изобилии встречается ДНК моа, несмотря на то что овцы появились там спустя сотни лет после исчезновения этих птиц. В современной Новой Зеландии живет множество овец. Много овец выделяют много мочи, которая проникает сквозь почву в глубокие слои и смешивается с ДНК моа.
В некоторых костях мамонтов содержится большой процент мамонтовой ДНК по сравнению с ДНК микроорганизмов и других экзогенных источников. Именно эти кости мы предпочитаем использовать для секвенирования. К сожалению, очень трудно определить соотношение ДНК мамонта и других видов ДНК в образце, не продолжив работу и не проведя эксперимент: нужно выделить ДНК, секвенировать ее и посмотреть, что получится.
К счастью, существует несколько общих правил, касающихся сохранности ДНК, которыми можно руководствоваться при выборе образца.
Во-первых, ДНК лучше сохраняется в условиях холода. Химические процессы, в ходе которых происходит ее распад, при низких температурах протекают медленнее. Среди подходящих мест для поиска – замерзшая почва (вечная мерзлота) Арктики, а также пещеры, расположенные на большой высоте. Тропические острова – совершенно не то место, где могла хорошо сохраниться ДНК, что станет плохой новостью для энтузиастов, желающих воскресить дронтов (хотя не все дронты умерли на Маврикии, некоторых из них перевезли в Европу живьем, и в музейных коллекциях можно найти множество их останков).
Во-вторых, ДНК разрушается под действием ультрафиолета. УФ-лучи наносят ДНК одинаковые повреждения при жизни и после смерти, но только у мертвых нет механизмов восстановления ДНК, оберегающих нас от развития ужасного рака кожи каждый раз, когда мы выходим на солнце. Это снова-таки указывает на пещеры как на идеальные места для обнаружения хорошо сохранившихся останков, и можно предположить, что быстро погребенные останки хорошо сохранятся с большей вероятностью, чем останки, пролежавшие незащищенными на поверхности в течение многих месяцев или лет.
В-третьих, вода наносит особенно сильный ущерб ДНК. Быстрое высушивание трупа и его нахождение в условиях низкой влажности или при отрицательной температуре способствует длительному сохранению ДНК. Древнюю ДНК удавалось выделить из естественным образом мумифицированных останков людей, степных бизонов, мамонтов и представителей других видов. Наконец, разные виды тканей в разной степени подвержены повреждению и разложению. К примеру, кости оказались лучшим источником неповрежденной ДНК, чем мягкие ткани, что, возможно, связано каким-то образом со структурой костного матрикса или же с костными клетками самими по себе. Еще один прекрасный источник хорошо сохранившейся ДНК – волосы и шерсть, так как гидрофобная оболочка волоса ограничивает количество воды и микробов, которые могут проникнуть внутрь и повредить ДНК.
Временные пределы выживания ДНК
Законы физики и биохимии говорят нам о том, что ДНК не живет вечно даже в наиболее подходящей для ее сохранения среде. Учитывая это, нам будет полезно знать возраст образца, геном которого мы собираемся секвенировать, чтобы предсказать, насколько успешным окажется этот проект. Хотя и не существует четкого правила, определяющего точный промежуток времени, свыше которого ДНК не выживает, результаты биохимического моделирования указывают на верхний предел около 100 тысяч лет при умеренной температуре окружающей среды. Но на практике то, насколько стар может быть образец с сохранной ДНК, очень сильно варьирует и зависит от того, где он был найден, какой это тип ткани (шерсть, зуб, кость, мумифицированные мягкие ткани, яичная скорлупа) и что происходило с этим образцом в течение всего этого времени. В образцах, находящихся в тепле, погруженных в воду и открытых для воздействия ультрафиолета, спустя год может не остаться ни одного фрагмента полезной ДНК. В Арктике, если образец лишился мягких тканей и сразу после этого был заморожен, а затем пролежал под землей в замороженном состоянии от момента погребения до момента раскопок, ДНК внутри него может просуществовать сотни тысяч лет.