Чтобы закрепить успех, Алекс отсеквенировал еще два фрагмента генов, имеющих по одной копии в ядре. Один из них кодировал белок, регулирующий выделение нейромедиаторов в мозге, а другой — белок, связывающий витамин А; этот последний вырабатывался палочками и колбочками в глазу. И в обоих случаях у Алекса все превосходно получилось.
Мы так долго бились с ядерной ДНК, что Алексовы результаты с мамонтом были встречены с величайшей радостью, и у меня несколько дней царил прямо праздник на душе. Но… не мамонты интересовали меня, совсем не мамонты. Неандертальцы — вот моя цель, а я точно знал, что в вечной мерзлоте неандертальцев не бывает. Я убедил Алекса вернуться к пещерным медведям и попробовать еще раз материал из Виндии: проверить, не сможем ли мы все же получить ядерную ДНК из остатков, не подвергшихся заморозке. Он проанализировал мтДНК нескольких пещерных медведей и выбрал кость, в которой, по всей видимости, ДНК содержалось больше всего. Мы сделали ее углеродный анализ — оказалось, 33 тысяч лет, что приблизительно соответствовало возрасту неандертальцев. Алекс стал работать именно с этой костью. Он попробовал выделить гены рибосомальной РНК — а в геноме множество их копий. И действительно, после амплификации Алексу удалось получить небольшое их количество. Далее он реконструировал последовательность из амплифицированных клонов. И выяснил, что у пещерных медведей она идентична соответствующим нуклеотидным последовательностям современных медведей.
Безусловно, это был успех, но с “ложкой дегтя”. Мы затратили столько усилий на ген с множеством копий в геноме; а что, если речь пойдет о гене, у которого есть только одна копия, например о vWF, с которым Алекс работал на мамонтовом материале? Тогда эксперименты заведомо обречены на провал. Алекс тем не менее попробовал и, как и ожидалось, потерпел неудачу. В глубине души — я никому об этом не рассказывал — я глубоко огорчился результатами экспериментов. Мы показали, что ядерная ДНК способна выдержать более десятка тысяч лет в вечной мерзлоте и что только следы даже самой распространенной ядерной нуклеотидной последовательности обнаруживаются в костях пещерных медведей. Разница между замораживанием и хранением в известняковой пещере была огромной.
В 1999 году мы опубликовали все открытия Алекса в прекрасной, на мой взгляд, работе[42], которую незаслуженно обошли вниманием. Там доказывалось, что ядерная ДНК сохраняется в остатках из вечной мерзлоты и что в ней даже можно выявить гетерозиготную позицию, такую, где две хромосомные копии несут разные варианты нуклеотидных последовательностей. Мы с уверенностью говорили о перспективах генетических исследований остатков из вечной мерзлоты и в конце работы написали: “В отложениях вечной мерзлоты и в других холодных средах находится множество животных остатков. В подобных остатках выявляются не только мтДНК, но и ядерные ДНК-последовательности, причем во многих случаях представленные в геноме единственной копией; это открывает перспективы использования ядерных локусов в филогенетических и популяционных генетических задачах, а также в исследованиях генов, определяющих фенотипические признаки”.
Со временем другие ученые продолжили эти исследования, однако произошло это нескоро, через пять или даже десять лет. Но что еще обиднее, на тот момент казалось, что если только неандертальца не раскопают в вечной мерзлоте, никогда нам не увидеть целого неандертальского генома.
Глава 10Вот они, ядра
Тем временем дела в лаборатории под моим руководством продвигались вперед, медленно, но верно. И все-таки, стоило мне остаться одному, например отгородившись от мира ремнем самолетного кресла или слушая в затемненном зале не слишком интересную лекцию, как прежняя досада возвращалась: ядерную ДНК неандертальцев так и не удалось выделить. Но я знал, я чувствовал, что она там есть, должна быть, и пусть ПЦР хоть сто раз отрицает это. Просто нужно как-то исхитриться достать эту ядерную ДНК.
Очередную попытку в этом направлении предпринял Хендрик Пойнар. Исчерпав терпение в бесплодных попытках отыскать ДНК флоры и фауны, заключенной миллионы лет назад в янтарь, он решил приложить силы к задаче более перспективной. Нам с ним в некотором смысле повезло: я попал на скучную конференцию и от нечего делать обдумывал наши разработки касательно выделения ДНК из помета животных. Например, мы изучали вымершего гигантского наземного ленивца из ледникового периода. Гигантские ленивцы оставили большое количество помета, который археологи окрестили милым научным термином “копролиты”. Даже больше — например, пол в некоторых пещерах в Неваде почти целиком состоит из окаменевших экскрементов гигантского ленивца. В статье 1998 года в Science Хендрик уже обозначил присутствие и сохранность в подобном материале мтДНК. Мы описали процесс реконструирования растительной ДНК из одного такого комка и показали, как с помощью копролитов можно воссоздать меню ленивца, пообедавшего незадолго до своей гибели 20 тысяч лет назад[43]. Такой прекрасный результат позволял предположить, что окаменевший помет содержит большое количество ДНК, в том числе и ядерной. Я предложил Хендрику попробовать это выяснить.
Хендрик начал с того, что применил наши прошлогодние химические уловки. Еще в 1985-м, когда занимался анализом мумий из Берлина, я заметил, что почти все вытяжки содержат некий компонент, который под ультрафиолетом светится голубым, и что если видишь голубое свечение, то ДНК в экстракте нет. Я не знал, что это за компонент, но наблюдение болезненно врезалось в память из-за тогдашнего разочарования: голубое свечение появлялось вместо розового, на которое я надеялся. По ходу изучения химических процессов, происходящих в тканях тела после смерти и в следующие десятки тысяч лет, мне попалась информация о явлении, известном как реакция Майяра. Этой химической реакцией занимается в основном пищевая индустрия. Так совпало, что моя мать была химиком-пищевиком, и она прислала мне кипу литературы на эту тему. Реакция Майяра происходит, когда нагревают обычные формы сахара или же подвергают их длительному воздействию сравнительно невысоких температур. В результате сахар образует связи с аминогруппами из белков и ДНК, и получаются длинные, спутанные молекулярные комплексы. Эта реакция запускается в разных процессах приготовления пищи; например, цвет и приятный запах свежеиспеченного хлеба являются ее побочными эффектами. Но меня интересовал не запах и цвет, а то, что продукты реакции в ультрафиолете светились голубым. Я подумал: а не происходит ли нечто подобное в химическом плане и с мумиями? В моей голове реакция Майяра ассоциировалась (наверное, неправильно) не только с голубым свечением, но и с характерным коричневым цветом мумий и их сладковатым запахом, вполне для меня приемлемым. И у меня возникло подозрение, что неудачи с выделением ДНК из мумий сопряжены с тем, что реакции Майяра связали древнюю ДНК с другими молекулами.
Ну что же, эту догадку можно проверить. В 1996 году в Nature вышла статья, описывающая химический реагент N-фенацил тиазолиум бромид, сокращенно PTB, разлагающий молекулярные комплексы, образованные реакцией Майяра[44]. Если добавить РТВ в испеченный хлеб, то он превратится обратно в тесто (правда в такое, которое уже никому не захочется испечь снова). Так как в готовом виде РТВ не продавался, Хендрик синтезировал его в лаборатории. Когда мы добавляли реагент в вытяжки из костей пещерных медведей или неандертальцев, то иногда действительно получалась более высококачественная амплификация. И когда Хендрик добавил РТВ в копролит из Невады возрастом в 20 тысяч лет, ему удалось амплифицировать и фрагменты vWF гена, того, который Алекс секвенировал из замороженного мамонта, а еще фрагменты двух других ядерных генов — все это к моему величайшему удивлению. Мы опубликовали результаты в июле 2003 года[45]. Наконец-то у нас получилось продемонстрировать, что ядерный геном сохраняется не только в условиях замораживания.
Вдохновленный результатами, я уже решил, будто все идет к тому, чтобы возобновить эксперименты по выделению ядерной ДНК из пещерных медведей, теперь с помощью РТВ. Печально, но ничего не вышло. Химические ухищрения не помогли. На самом деле в какой-то момент стало понятно, что копролит из Невады — это редчайшее исключение, где РТВ срабатывает. Исследования копролитов тем не менее укрепили меня во мнении, что ядерная ДНК в остатках есть, нужно только придумать новый способ ее найти.
Я спрашивал всех, кого только можно, о способах секвенирования небольших количеств ДНК. В числе прочих я подверг “допросу” шведского биохимика Матиаса Улена, неутомимого изобретателя и предпринимателя от биотехнологий. Матиас обладал безграничной энергией и с детским восторгом относился к новым идеям, заражая своим энтузиазмом творческих людей, неизменно собиравшихся вокруг него. После встреч с ним я всегда возвращался в приподнятом настроении. Одной из творческих личностей в его окружении был Поль Нюрен. Десять лет назад он, несмотря на всеобщий скептицизм, изобрел и разработал новый метод секвенирования ДНК. Матиас тотчас же разглядел научный потенциал изобретения Поля. Еще он осознавал, что технологии секвенирования ДНК пора уже обновлять: мы до сих пор использовали методики, разработанные Фредом Сэнгером в Англии, за что он и получил в 1980 году свою вторую Нобелевскую премию по химии.
Метод секвенирования Сэнгера основан на прикреплении нуклеотидов поочередно друг за другом ДНК-полимеразой, ферментом, который выстраивает новую цепочку ДНК на матрице имеющейся цепочки. В реакции секвенирования ДНК-полимераза берет старт от праймера в назначенном месте ДНК. Далее небольшие порции каждого из четырех нуклеотидов метят разными флуоресцентными красителями и, кроме того, немного изменяют их химически. В результате после встраивания такого измененного нуклеотида реакция секвенирования останавливается именно в месте его прикрепления. Получаются цепочки ДНК разной длины, и концы таких фрагментов раскрашены разными цветами. По этим цветам можно понять, что за нуклеотид сидит на конце. Эти фрагменты — а они разной длины — подвергают процедуре электрофореза. При электрофорезе кусочки ДНК распределяются в геле соответственно своим размерам (длинам, молекулярным весам). И тогда можно посмотреть, как цветные метки и, следовательно, нуклеотиды в этом геле расположены: например, метка и нуклеотид в 10-й позиции от места старта, в 11-й позиции, в 12-й и т. д. На самом лучшем оборудовании для считывания, какое использовалось, к примеру, в проекте “Геном человека”, можно анализировать сразу сотни фрагментов ДНК длиной до 800 нуклеотидов. И что же проделал Поль Нюрен в лаборатории Матиаса? А вот что: он изобрел новый метод секвенирования, так называемый метод пиросеквенирования. И хотя пиросеквенированию предстояло еще хорошенько повзрослеть, но в перспективе оно обещало стать и быстрее, и проще метода Сэнгера.