Уже на ранних этапах развития, когда эмбрион был еще очень мал, клетки по-разному реагировали на сигналы в зависимости от места и времени, например при создании первичной полоски. Например, во время гаструляции эмбрион был достаточно мал, чтобы градиент концентрации сигналов от ПВЭ определял примерную ориентацию оси «голова – хвост». Однако по мере роста эмбриона простой механизм градиентов концентрации стал все меньше подходить для разметки сложных структур организма. Чем длиннее ткань, которая должна быть размечена с помощью одного концентрационного градиента, тем более пологим будет градиент относительно размера любой клетки (рис. 23). Чем градиент более пологий, тем меньше разница концентраций для соседних клеток. Соответственно, клетке труднее «принимать решения», связанные с ее точным местоположением в эмбрионе. Системы концентрационных градиентов было вполне достаточно, чтобы наметить «черновые» различия поведения клеток раннего эмбриона, однако она просто не справится с задачей нанесения точной детальной разметки на тело, имеющее гораздо большую площадь.
Эмбрион решает эту проблему, не отбрасывая идею градиентов окончательно: он использует короткий градиент, чтобы определить границы одного сомита. Затем этот градиент, по длине равный длине сомита, передвигается вдоль эмбриона и используется снова и снова. Механизм, с помощью которого это достигается, кажется фантастическим по своей сложности, но его существование было подтверждено многочисленными кропотливыми экспериментами над эмбрионами различных видов животных. Несмотря на то что нам еще многое предстоит узнать об этом механизме, на данный момент мы знаем достаточно, чтобы сказать, что он вполне реален.
В течение всего этого процесса клетки мезодермы, еще не сегментированной и, следовательно, находящейся позади уже сформированных сомитов, синтезируют сигнальный белок под названием FGF.[87] Они делают это по умолчанию, и каждая из клеток будет продолжать синтезировать FGF, пока что-то ее не остановит. Клетки могут обнаружить секретированный ими же FGF, и это предотвращает такие изменения их адгезионных систем, которые необходимы для формирования сомита. Другими словами, еще не сегментированная мезодерма продолжает говорить себе «еще не пора» на языке FGF.[88]
Рис. 23. Градиенты концентрации вещества, распространяющегося от источника, хорошо определяют положение клеток на небольших расстояниях, но с увеличением расстояния различия концентрации этого вещества для соседних клеток становятся незначительными. Учитывая «шум», свойственный биологическим системам, клеткам становится все труднее определить, находятся ли они внутри или же снаружи той концентрационной области, в которой их поведение должно измениться определенным образом. Фиксированные градиенты, следовательно, не подходят для разметки больших и сложных структур, формирование которых требует использования многих вариантов клеточного поведения, и не могут быть использованы для того, чтобы наметить границы между будущими сомитами эмбриона
Клетки, которые уже находятся в процессе создания сомитов, не выделяют FGF. Вместо этого они синтезируют еще одну сигнальную молекулу, ретиноевую кислоту, которая также образуется клетками в голове эмбриона. Ретиноевая кислота распространяется от последнего сомита к еще не сегментированной мезодерме. Она не может распространяться очень далеко, потому что мезодермой синтезируется молекула, которая разрушает ее. Тем не менее она может проникать в мезодерму в значительной концентрации на десятую долю миллиметра.[89] Ретиноевая кислота останавливает синтез FGF в мезодерме. Таким образом, образуется узкое «окно», или «разрешающая зона», в еще не сегментированной мезодерме, в котором не хватает FGF, чтобы предотвратить образование сомита (рис. 24).
Рис. 24. Противоположно направленные градиенты ретиноевой кислоты (РК) и FGF. Градиент РК имеет максимум на головном конце тела, а FGF – на хвостовом конце. Эти градиенты задают узкую «разрешающую зону», в которой клетки могут создавать новый сомит
Определение границ этого окна в пространстве является очень важной частью механизма, в ходе которого новые сомиты образуются один за другим, но этого пока недостаточно, чтобы решить проблему. В конце концов, если клетки смогут превратиться в сомиты, как только разрешающая зона перемещается достаточно далеко к хвосту, они будут делать это одна за другой. Никогда у каждого из сомитов не будет четкой задней части, потому что всегда другие клетки, избавившись от влияния ингибиторов, попытаются сказать «и я тоже!». Такая система не сможет разделить ткани на блоки, и все, что получится, это очень длинный, бесформенный «мегасомит». Однако эту проблему можно решить, если клетки не будут формировать сомит, пока разрешающая зона не переместится на расстояние, равное длине сомита, к хвосту.[90] Тогда все клетки в этой зоне будут иметь возможность участвовать в процессе. Но это возможно только тогда, когда разрешающая зона переходит на расстояние, равное длине следующего сомита, и так далее. Кажется, именно так устроена эта система в действительности: переключение между клетками в разрешающей зоне регулируется «тиканьем» молекулярных часов.
Эти «часы» состоят из сети белков, взаимно контролирующих синтез друг друга. В некоторых случаях они, прямо или косвенно, подавляют собственный синтез. Чтобы понять, как контролируемый синтез белков может превратиться в часы, стоит рассмотреть очень простую «игрушечную» систему. Она намного проще, чем в случае реальных сомитов: эта система состоит из одного-единственного гена, в последовательности которого закодирован белок, который синтезируется в момент активности гена и его же дезактивирует. Другими словами, белок подавляет собственный синтез. Будем считать, что подобный ген присутствует в клетках, так что работа основных биохимических процессов, связанных с синтезом белка, нам уже гарантирована. Напомним, что с активных генов сначала транскрибируются РНК – «копии». Затем с этой РНК в процессе трансляции синтезирует необходимый белок (глава 1).
Предположим, что процессы транскрипции и трансляции происходят за очень короткое время по сравнению со временем жизни РНК и молекул белка. Тогда в нашей системе-«игрушке» концентрация белка постепенно выйдет на стабильный уровень. Если в начале работы системы концентрация белка ниже этого уровня, активность гена не будет сильно подавляться. РНК будет синтезироваться и транслироваться, а концентрация белка при этом вырастет. Появится больше молекул белка, которые будут ингибировать активность гена, и производство новых белковых молекул будет снижаться до тех пор, пока не выйдет на уровень, позволяющий лишь компенсировать потерю белка, связанную с окончанием срока жизни молекул (рис. 25, а). Если же концентрация этого белка изначально слишком высока, работа гена будет подавляться, и новые белки не будут синтезироваться до тех пор, пока исходная концентрация белка не понизится за счет старения и распада молекул (рис. 25, б). Основная функция этой сетевой системы состоит в том, чтобы поддерживать концентрацию белка в четко заданных пределах. Для белков-долгожителей (срок их жизни измеряется в часах и днях) небольшое запаздывание в работе системы, связанное с паузами на транскрипцию и трансляцию (на них уходят минуты), не имеет большого значения. Такие системы используются клетками для поддержания количества отдельных молекул в пределах допустимого.
Рис. 25. Поведение системы, в которой белок (обозначен жирной линией) подавляет синтез собственной РНК (обозначена тонкой линией). В результате возникает запаздывание, незначительное по сравнению со временем жизни белка. Даже если исходная концентрация белка слишком низкая (а) или слишком высокая (б), она все равно придет к стабильному значению. Сравните этот рисунок с рис. 26
Если теперь предположить, что белок «живет» так недолго, что время, необходимое для его создания, сопоставимо со временем его жизни, поведение системы становится совершенно другим. Рассмотрим ситуацию, когда в нашей модельной системе концентрация белка очень низкая. В присутствии небольшого количества белка транскрипция гена не подавляется и может проходить быстро. С некоторым запаздыванием увеличивается концентрация РНК, а немного позже, по мере трансляции РНК, вырастет и концентрация белка. С увеличением числа молекул белка транскрипция гена подавляется, но, пока концентрация РНК достаточно высока, белок будет производиться за счет трансляции этой РНК до тех пор, пока она не деградирует. В результате концентрация белка превысит «пороговый» уровень (рис. 26). По-настоящему высокой концентрации белка достаточно, чтобы полностью выключить транскрипцию гена. По мере того как молекулы РНК и белка деградируют, концентрация белка уменьшится, и транскрипция начнется снова. Однако из-за запаздывания, связанного с транскрипцией и трансляцией, понадобится некоторое время, прежде чем концентрация белка начнет расти. Быстрое разрушение белка говорит о том, что его концентрация резко уменьшается и «пороговый» уровень опять будет перейден, но уже в обратном направлении. В системе опять становится слишком мало белка, а это значит, что цикл начнется снова. Запаздывания, связанные с транскрипцией и трансляцией, вызывают многократные резкие скачки системы: от низких значений концентрации к высоким. В результате вместо стабильности мы получаем чередование высоких и низких уровней концентрации белка. Это напоминает тиканье часов.
Сетевая система «часов сегментации» значительно сложнее, чем один белок, контролирующий собственный синтез.[91] Судя по всему, функциональное ядро этих часов основано на системе реакционных петель с отрицательной обратной связью (это означает, что их компоненты репрессируют сами себя), похожих на те, что уже были описаны. Они зависят от белков, время жизни которых коротко по сравнению со временем, которое затрачивается на транскрипцию и трансляцию, необходимые для их синтеза. В работу часов вовлечено большое количество белков. Они способствуют стабильной работе часов и «сверяют» часы соседних клеток. У мышей полный цикл «часов сегментации» занимает около двух часов. Одна фаза этого цикла дает разрешение любой клетке, находящейся в разрешающей зоне еще не сегментированной мезодермы (с низким содержанием FGF), принять участие в создании сомита. Идет чередование фаз. В короткую фазу часов («тик») клетки в окне с малым содержанием FGF могут стать клетками сомита. В долгую фазу («так») они не участвуют в образовании сомита, даже если находятся в пределах разрешающей зоны. Такое чередование означает, что у разрешающей зоны есть запас времени для продвижения к хвостовой части на длину сомита до того, как клетки, обнаружившие, что они находятся в этой зоне, смогут поучаствовать в создании сомита.