Сначала небольшой экскурс в историю клонирования. Долли (англ. Dolly) — самка овцы, первое млекопитающее, успешно клонированное из клетки другого взрослого существа. Эксперимент был поставлен в Шотландии, где Долли и родилась 5 июля 1996 года. Клонирование произвела группа учёных, возглавляемая Я. Уилмутом и К. Кэмпбелом. Пресса объявила о рождении Долли лишь через 7 месяцев — 22 февраля 1997 года (343). Овца Долли умерла 14 февраля 2003 года, прожив 6,5 лет. При клонировании Долли было проведено 277 экспериментов и все неудачные, кроме последнего. В процессе «создания» Долли, в 277 яйцеклеток были перенесены ядра, взятые из вымени животного-донора. Из них образовалось 29 эмбрионов, один из которых, Долли, выжил (186, 343).
Следует отметить, что в популярной литературе имеются искажения того, что на самом деле было сделано. Например, считается, что из яйцеклетки второй "мамы" было удалено ядро. Вместо него в яйцеклетку поместили ядро из клетки молочной железы "мамы" номер один. Полученный гибрид пересадили в матку третьей приемной "мамы". Рожденная же от нее Долли явилась точной генетической копией первой овцы.
Здесь не все утверждения верны. 1. Для Долли не стали пересаживать ядро, а просто с помощью электрического импульса индуцировали слияние яйцеклетки с соматической клеткой, которая долгое время подвергалась голоданию (343). Мне думается, что, скорее всего, в качестве источника ядра для клонирования Долли была взята не соматическая клетка от животного, а стволовая клетка из молочной железы взрослой овцы и уже из нее произошла та клетка, которую использовали после долгого выращивания в культуре клеток. 2. Долли — это не точная генетическая копия, а результат взаимодействия точно того же набора нуклеотидов, что и у первой генетической мамы, и наследственных факторов цитоплазмы от второй мамы — продуцента яйцеклетки. Но, по сути, Долли даже не является клоном. Клоном называется группа организмов, имеющих идентичный геном (включая и внегенетические механизмы), после бесполого размножения от одного предшественника. Долли имеет другие генетические значимые факторы цитоплазмы, не такие, как ее генетическая мама, от которой взято соматическое ядро.
4.14. КТО БЫЛ ПЕРВЫМ?
Не верно расставлены и приоритеты. Увилмут и Кэмпбелл (343), клонировавшие Долли, не были первыми. Возможность клонирования эмбрионов позвоночных впервые была показана в начале 50-х годов в опытах на амфибиях. Впервые клонирование через ядро (пересадка ядра соматической клетке в яйцеклетку, лишенную своего ядра) было осуществлено на лягушках американскими исследователями Бриггсом и Кингом в 1952 г. (181), которые разработали микрохирургический метод пересадки ядер эмбриональных клеток с помощью тонкой стеклянной пипетки в лишенные ядра (энуклеированные) яйцеклетки. Они получили лягушку из соматического ядра, пересаженного в яйцеклетку. В своих экспериментах Бриггс и Кинг в 1952 г. пересадили ядро из клетки кишечного эпителия в яйцеклетку лягушки, лишенную ядра. Если пересадить в яйцеклетку лягушки, у которой ультрафиолетовым излучением разрушено ядерная ДНК, ядро, взятое от головастика, то получится зигота. В большинстве случае она гибнет, но в небольшом проценте экспериментов из зиготы может вырасти недоразвитая лягушка — головастик (181). Но здесь случились странности. Если ядро эпителиальной клетки бралось от взрослой лягушки, то полученный клон останавливался в своем развитии на уровне головастика. Если ядро бралось от головастика, то получалась взрослая лягушка (181, 330).
Более воспроизводимые результаты были чуть позже получены Гёдоном (227, 228), который первым в опытах с южноафриканскими жабами Xenopus laevis в качестве донора ядер использовал не зародышевые клетки, а уже вполне специализировавшиеся клетки эпителия кишечника плавающего головастика (227).
Ядра яйцеклеток реципиентов (получателей ядер) он не удалял хирургическим путем, а разрушал ультрафиолетовыми лучами. В большинстве случаев реконструированные яйцеклетки не развивались, но примерно десятая часть их них образовывала эмбрионы. 6,5 % из этих эмбрионов достигали стадии бластулы, 2,5 % — стадии головастика и только 1 % развился в половозрелых особей. В последующих работах как сам автор, так и многие другие исследователи не смогли подтвердить данные этих первых опытов.
Позже Гёдон модифицировал эксперимент (228). Поскольку большинство реконструированных яйцеклеток (с ядром клетки кишечного эпителия) погибали до завершения стадии гаструлы, он попробовал извлечь из них ядра на стадии бластулы и снова пересадить их в новые энуклеированные яйцеклетки (такая процедура называется “серийной пересадкой” в отличие от “первичной пересадки”). Число зародышей с нормальным развитием после этого увеличивалось, и они развивались до более поздних стадий по сравнению с зародышами, полученными в результате первичной пересадки ядер.
Таким образом, показано, что в случае амфибий донорами ядер могут быть лишь зародыши на ранних стадиях развития. Опыты с амфибиями показали, что ядра различных типов клеток одного и того же организма генетически идентичны и в процессе клеточной дифференцировки постепенно теряют способность обеспечивать развитие реконструированных яйцеклеток, однако серийные пересадки ядер и культивирование клеток в пробирке в какой-то степени увеличивает эту способность. Интересно, что у растений любая клетка может дать взрослую особь.
Первым ученым, который в 1986 г. опубликовал результаты клонирования млекопитающих, был эмбриолог С. М. Увиллэдсен (341, 342). Он предложил вместо клеток раннего эмбриона, куда раньше пересаживались ядра соматических клеток при создании клонов, использовать яйцеклетку. Некоторые авторы называют подобные эксперименты клонированием амфибий, хотя правильнее называть их клонированием эмбрионов амфибий, так как в этом случае мы размножаем бесполым путем не взрослых животных, а зародышей. До клонирования Долли уже предпринимались попытки создать полноценные клоны. Среди них — овцы Мэган (англ. Megan) и Мораг (англ. Morag), созданные той же группой исследователей из эмбриональных клеток (а не клеток взрослых животных). Статья о них была опубликована в журнале Природа (Nature) в 1996 г. (186).
4.15. ПРИНЦИПЫ КЛОНИРОВАНИЯ ДОЛЛИ
Чтобы понять принцип клонирования, надо вспомнить такие понятия, как соматическая клетка, геном, пересадка ядра. У человека все клетки организма могут быть разделены на половые, которые участвуют в образовании зрелых половых клеток, и соматические (от слова сома, тело), которые образуют тело. Отличия их в том, что соматические клетки широком используют свой генетический материал для жизнедеятельности, тогда как половые почти нет, сохраняя его в крайне конденсированной форме, что препятствует возникновению мутаций. Кроме того в процесс созревания половых клеток те из них, которые оказываются мутированными (где наследственное вещество изменено), из дальнейшего процесса удаляются. Соматические же клетки лишены действенных механизмов защиты от мутаций и удаления мутированных клеток.
Поэтому в них гораздо чаще можно найти мутации.
Сначала у животного медикаментозно стимулируют созревания яйцеклетки и затем с помощью ее тонкой трубки ее отсасывают из брюшной полости. Затем к ней в пробирке добавляют сперматозоиды, которых сливается с яйцеклеткой, оплодотворяя ее. Начинается развитие нового организма, в пробирке, но вне матки способность его клеток делиться очень ограничена. Через 13 суток, как правило, эмбрион, развивающийся вне матки человека, гибнет. Поэтому, например, британское законодательство устанавливает, что можно доращивать эмбрион в пробирке до 13 суток с целью получения клеточного материала.
Работа с реконструированными яйцеклетками крупных домашних животных, коров или овец, идет следующим образом. Сначала их культивируют не in vitro, а in vivo — в перевязанном яйцеводе овцы — промежуточного (первого) реципиента. Затем их оттуда вымывают и трансплантируют в матку окончательного (второго) реципиента — коровы или овцы соответственно, где их развитие происходит до рождения детеныша. Увилэдсен предложил заключать реконструированные яйцеклетки в агаровый цилиндр, который он затем трансплантировал в перевязанный яйцевод овцы (341). Культивирование соматических клеток в среде с резко пониженным содержанием сыворотки крови оказалось несущественным элементом метода (330).
Далее метод включает следующие этапы: 1. Удаление ядра из яйцеклетки с помощью микропипетки. 2. Внедрение в цитоплазму оставшейся яйцеклетки ядра соматической клетки (сейчас принята другая методика, которая оправдала себя в случае с Долли — соматическая клетка с помощью микроманипулятора помещалась под блестящую оболочку и затем под воздействием электрического импульса обеспечивалось ее слияние с яйцеклеткой). 3. Активация полученной зиготы с целью стимулировать ее деление. Для этого на зиготу воздействуют таким образом, чтобы вызвать повышение концентрации ионов кальция в ее цитоплазме. Кроме того с помощью лекарств в зиготе блокируется синтез белков. 4. Культивирование в пробирке начавшего делиться эмбриона. 5. Подсадка эмбриона суррогатной матери (330).
Если при манипуляциях с яйцеклеткой сохраняется ее блестящая защитная оболочка, состоящая из внеклеточного вещества, то соматическая клетка просто внедряется в пространство между плазматической мембраной безъядерной яйцеклетки и блестящей оболочки и затем вызывается с помощью определенного электрического импульса слияния яйцеклетки и соматической клетки. Затем повышают содержание ионов кальция в цитоплазме зиготы и добавляют блокаторы синтеза белка. Эти два стимула достаточные для того, чтобы заставить зиготу делиться (дробиться).
После того, как клонировали овечку Долли, появляются все новые и новые сообщения о клонировании все новых и новых видов животных. В настоящее время получены клоны многих других млекопитающих (292). Мышь удалось клонировать, используя ядра из полностью зрелых нервных клеток (205).