В начале XVIII века при понтификате Климента XI на Вилле Бельведере был устроен Музео Экклезиастико (Museo Ecclesiastico, Церковный музей), состоящий в основном из каменных рельефов с изображениями и надписями времени раннего христианства. Собственно говоря, это и был первый публичный музей в Ватикане. Организация его была далека от совершенства, Вилла Бельведере плохо подходила для музейной экспозиции, и Музео Экклезиастико просуществовал недолго. Тем не менее, благодаря Клименту XI, мысль создать музей в Ватикане забродила в головах курии, и во время понтификата Климента XII часть коллекций Ватикана была выставлена в специально отстроенной Галерее Клементина, рядом с Библиотекой Ватикана. Экспозиция состояла из ваз, монет и манускриптов и производила впечатление демонстрации раритетов. Бенедикт XIV уделял новому музею особое внимание, при нем коллекция выросла, в том числе и за счет частных дарений, довольно хаотичных по составу. Тут были и древности, и живопись, и фарфоровые вазы. Для того чтобы придать коллекциям Ватикана некое смысловое единство, в галерее Урбана VIII был организован Музео Кристиано (Museo Cristiano, Христианский музей), реанимировавший замысел Музео Экклезиастико. При Клименте XIII было решено реорганизовать ту часть коллекции, что занимала Галерею Клементина, превратив ее в Музео Профано (Museo Profano, Мирской музей) и сосредоточив в ней произведения античного искусства. Оба музея находились при Библиотеке Ватикана и считались ее частью. В это же время вновь стал доступен для обозрения и Antiquario delle Statue, который, однако, не считался частью Музео Профано, а по-прежнему представлял собой отдельную экспозицию, и деревянные ставни, теперь уже использовавшиеся не для сокрытия, а для защиты статуй от непогоды, сохранялись. Папа назначил директором нового музея Иоганна Иоахима Винкельмана, главного пропагандиста древнего искусства, что подчеркивало значимость именно античной части коллекции.
С создания Музео Кристиано и Музео Профано начинается прямая линия развития Музеев Ватикана, вскоре ставших одними из величайших музеев мира, без которых немыслима европейская культура. Папы XVIII века вернулись к тому, что было начато при Юлии II, и в эпоху Просвещения Ватикан вновь открыто признал языческую античность частью своего культурного наследия, но с оговоркой. Коллекции Ватикана оказались разделены на Музео Кристиано и Музео Профано, и таким образом музеефицированная античность была отделена от истории церкви. Прямой и открытый диалог «Афинской школы» и «Диспута» был уже невозможен.
Новые музеи пользовались большой популярностью у знатных посетителей Рима, свидетельствуя о просвещенности Ватикана. В начале 1770-х годов Климент XIV, установивший контроль над раскопками и над рынком древностей, значительно пополнил собрание новыми приобретениями и находками. Места для экспонирования не хватало, поэтому было решено перестроить часть дворцовых помещений, расширив музей за их счет. Роскошно декорированные залы были открыты в 1772 году, и в честь своего создателя новый музей получил имя Музео Клементино. Antiquario delle Statue сохранял свою самостоятельность, но был переделан. Для защиты статуй были выстроены особые портики, а деревянные ставни убраны.
Музео Клементино сразу же стал гордостью Ватикана – подобных музеев в Европе было мало. Пий VI, сменивший Климента XIV, продолжил расширение музейных пространств. Он постановил полностью отдать Виллу Бельведере под музейные коллекции, сделав статуи, стоявшие в Antiquario delle Statue, частью экспозиции. Вилла Бельведере была безжалостно перестроена, фрески Пинтуриккио и Мантеньи исчезли, террасы Браманте переделаны, и все залы и галереи, в которых было выставлено античное искусство, были объединены. Музео Кристиано, теперь называвшийся Музео Сакро (Museo Sacro, Религиозный музей), и Музео Профано, считавшиеся частью Библиотеки Ватикана, также соединились с залами скульптуры и оказались частью обширнейшего музейного пространства, сохраняя свою самостоятельность. Разросшийся музей стал называться Музео Пио-Клементино. Он до сих пор является основным в составе Музеев Ватикана, и многие из его залов и галерей, отстроенных в духе неоклассицизма, остались неизменными до сегодняшнего дня. Собрание древнего искусства теперь экспонировалось прекрасно, однако картины, которых в папских собраниях было много, были практически недоступны для обозрения и никому не известны. Пий VI озаботился созданием самостоятельной галереи живописи, и его решение в первую очередь определялось тем, что папа хотел выставить алтарные картины собора Святого Петра, которые еще в начале XVIII века заменили мозаиками, сделанными в мастерских Ватикана. Поступившие из собора «Мученичество святого Эразма» Никола Пуссена, «Мученичество святых Прокесса и Мартиниана» Валантена де Булонь и «Месса святого Григория» Андреа Сакки, хранившиеся во внутренних покоях папских дворцов, стали главным украшением экспозиции. Для новой картинной галереи выделили три внушительных зала.
Картинная галерея, открытая в 1790 году, просуществовала недолго. Спокойствие, которым наслаждался Рим, с середины XVI века не знавший больших войн, за исключением мелких стычек и поддержки антитурецкой коалиции, закончилось. Папская область, избегавшая участия в каких-либо прямых вооруженных столкновениях на протяжении двух столетий, оказалась втянутой в водоворот общеевропейского конфликта, вызванного Французской революцией. В 1796 году французы, как во время итальянских войн Ренессанса, перешли Альпы и, разбив союзных папе австрийцев, вторглись в Папскую область. У пап, давно отказавшихся от военного вмешательства в политику, не было ни малейшей возможности противостоять революционным войскам. Спасая Рим от разгрома, Пий VI в 1797 году вынужден был подписать с Францией унизительный Толентинский трактат. Условия мирного договора, продиктованные генералом Бонапартом, командовавшим французскими войсками в Италии, были крайне тяжелы для Ватикана. Независимость Папской области была ограничена, Пия VI заставили пойти на большие территориальные уступки в пользу образованной французами Цизальпинской республики и выплатить огромную контрибуцию. Кроме этого, договор обязал папу отдать Франции сокровища искусства из церквей Рима и собраний Ватикана. Все знаменитые античные скульптуры были вывезены, так что Antiquario delle Statue опустел. Коллекция Юлия II, в том числе и Аполлон Бельведерский, в первый и последний раз покинула Рим. Картины собора Святого Петра также были конфискованы французами, и ограбленная картинная галерея была закрыта. После того как произведения искусства после долгого пути прибыли в Париж в 1798 году, Наполеон Бонапарт устроил нечто вроде древнеримского триумфа, провезя отнятые у законных владельцев картины и статуи в открытых повозках по всему городу и с помпой водрузив их в Лувр, вскоре переименованный в Музей Наполеона. История Музеев Ватикана, как всегда, оказалась теснейше переплетена с историей папства. Опустевшие залы Музео Пио-Клементино производили удручающее впечатление. На месте Аполлона Бельведерского, Лаокоона и других всемирно известных шедевров теперь стояли второстепенные, мало кому известные произведения, заполняя пустоты. Трагична была и судьба Пия VI, как будто разделившего судьбу сокровищ Ватикана. Воспользовавшись стихийно возникшим мятежом папской гвардии, убившей нескольких французов, генерал Бонапарт отдал приказ оккупировать Рим, в котором была провозглашена республика. С оккупацией начался неприкрытый грабеж папских дворцов, в том числе и собраний Ватикана. Пия VI арестовали и под конвоем увезли из Рима сначала в Сиену, а затем во Францию. Французское правительство во главе с Бонапартом пыталось заставить его подписать отказ от светской власти над Папской областью в обмен на освобождение и возвращение в Рим, от чего Пий VI решительно отказывался. Для того чтобы сломить его упорство, папу заточили в крепость в Валансе, на юге Франции, где он и умер в 1799 году, так ничего и не подписав.
Новый папа, Пий VII, был избран в 1800 году конклавом кардиналов, собравшихся в Венеции, так как Рим находился под полным контролем французов. В это время во Франции произошли изменения: в 1799 году генерал Бонапарт провозгласил себя первым консулом республики, в 1802 году – пожизненным, задумав узаконить преемственность своей власти. На смену революционности пришел новый консерватизм, и генералу Бонапарту, вскоре решившему стать императором Наполеоном I, надо было урегулировать свои отношения с религией. Пию VII ничего не оставалось, как пойти на сделку. Приехав во Францию, он присутствовал на коронации Наполеона императором в Париже в 1804 году, произошедшей в соборе Нотр-Дам. Наполеон хотел, чтобы папа остался во Франции навсегда, но Пий VII уехал вопреки его желанию и, так как император, только что коронованный папой, уже не посмел задержать его насильно, достиг Рима в 1805 году. После возвращения Пий VII пытался отстаивать самостоятельность Святого престола, что привело к оккупации Рима французами, присоединению Папской области к Франции и объявлению Рима свободным городом. В 1809 году папа снова был доставлен во Францию, а королем Рима Наполеон провозгласил своего сына от Марии-Луизы, Наполеона II. Время господства французов и полной потери самостоятельности Рима было более печальным временем в истории Музеев Ватикана, чем понтификат Адриана VI, задумывавшего сбить фрески Сикстинской капеллы.
После отречения Наполеона Пий VII тут же вернулся в Рим. Венский конгресс восстановил и узаконил самостоятельность Папской области и постановил отдать назад все произведения искусства, конфискованные Наполеоном. Уже в 1815 году большая часть предметов, вывезенных во Францию, прибыла в Рим. Пий VII придавал большое значение восстановлению Музеев Ватикана, и в начале 1816 года была открыта обновленная экспозиция Музео Пио-Клементино. Несмотря на то что некоторые вещи были оставлены во Франции, она увеличилась, в особенности собрание живописи, так как по папскому распоряжению картины, экспроприированные у церквей Рима и других городов Папской области, по возвращении были оставлены в собрании Ватикана. Многие возражали против такого самоуправства, но папа обосновывал свое решение тем, что соглашение о реституции было достигнуто благодаря его усилиям и он вправе распоряжаться его результатом. Новые поступления увеличили как число экспонатов картинной галереи, так и ее ценность, ибо среди них оказались такие шедевры, как «Преображение» Рафаэля и «Положение во гроб» Караваджо. Новая коллекция расположилась в не использовавшихся со времени Юлия II апартаментах Борджиа и была открыта для посещения в 1817 году. Эти комнаты, однако, были неудобны и тесны, поэтому в дальнейшем галерея неоднократно перемещалась. Растущая известность Музеев Ватикана играла все большую роль в международном престиже Рима, и папы заботились об их дальнейшем устройстве и расширении.