Genentech закодировали два крайних фрагмента отдельными генами, чьи белки затем соединялись друг с другом. Метод с использованием дрожжей не столь заковырист и более продуктивен.
Чтобы научиться внедрять гены в эукариотические клетки, потребовались дальнейшие исследования и изобретения. Лишь немногие из эукариот имеют плазмиды, и эукариотические гены, как правило, встраивают в хромосомы, чтобы они надежно экспрессировались в составе общего генома. (Такой вариант модификации иногда предпочитают и в бактериальной инженерии: внедрение нужного гена в хромосому бактерии дает больше гарантий на его сохранение, поскольку плазмиды могут теряться при клеточных делениях.) Методы модификации эукариотических геномов развивают уже не один десяток лет, однако до недавнего времени они были неэффективными, неточными и трудоемкими. Все радикально изменилось лишь с появлением системы CRISPR/Cas9, поэтому я не стану подробно разбирать другие подходы, а ограничусь лишь общим обзором их тактики и примеров, где приложение таких усилий может быть оправданным.
Если представить эукариотический геном как огромную библиотеку с закрытым фондом – вроде Библиотеки Конгресса или частного собрания, – то наша задача состоит в том, чтобы как-то втиснуть на полку новую книгу. Мы могли бы оставить ее в общественном зале, но библиотекарь вряд ли отнесет ее на полку за дверью: эукариотические клетки не поглощают и не встраивают в свои геномы случайные обрывки ДНК. Наши шансы увеличиваются, когда библиотеку ремонтируют или перевозят на новое место, поскольку в суматохе нашу книгу могут подложить к остальным. Такую возможность предоставляют только что оплодотворенные яйцеклетки, пока в них не объединились родительские хромосомы. Если микроинъекцией ввести молекулы ДНК в формирующийся зародыш, они могут встроиться в геном7. Сразу после разработки эта техника редко оказывалась успешной и позволяла внедрять фрагмент ДНК лишь в случайные места генома, ставя под угрозу целостность генов. Дальнейшие усовершенствования повысили ее эффективность и даже привнесли во внедрение ДНК некоторую степень прицельности (таргетированности). Сейчас это стандартный метод создания трансгенных мышей, например, с генами флуоресцентных белков для слежения за клеточными функциями (см. главу 2).
Другой вариант решения библиотечной задачи – привлечь кого-то, кому будет легче проникнуть в библиотеку, – например, профессионального взломщика. Мы часто прибегаем к помощи вирусов. Вирусы запускают свои геномы в клетки и реплицируют их там либо в виде независимых молекул, либо в составе генома хозяина. Маленькие и проворные вирусы не склонны брать дополнительный груз, но немного лишнего генетического материала в них все же можно втиснуть, и тогда модифицированные вирусные частицы доставят его в клетки заражаемого организма. Вирусная доставка ДНК имеет преимущества перед микроинъекцией, поскольку все делает сам вирус, а не лаборант с тонкой иглой, и работать можно с разными типами клеток, а не только со свежеоплодотворенной яйцеклеткой. Но у этих методов сходные недостатки: они не особенно надежны и таргетны, то есть избирательность встраивания привнесенной вирусом ДНК невысока. Когда мы создаем трансгенных мышей, нам неважно, что доля успешных процедур далека от идеала. Мы проводим отбор и дальше изучаем только правильно трансформированных мышей. Но если мы хотим разработать лекарственный препарат для человека, наши требования к надежности и точности сильно ужесточаются.
Бактерии – даже те немногие из них, которые могут проникать в другие клетки и причинять им вред, – обычно не изменяют геномы эукариот. Но есть и редкие исключения. Почвенный микроб Agrobacterium tumefaciens заражает корни растений, когда у него появляется такая возможность. Эта бактерия отрезает особый фрагмент своей плазмидной ДНК (Т-ДНК) и вводит его в растительную клетку вместе с белками, которые направляют Т-ДНК в ядро и вынуждают растение задействовать механизм репарации (починки) ДНК, чтобы внедрить бактериального засланца в свой геном. В итоге синтезируются закодированные в Т-ДНК вещества, провоцирующие опухолеобразование на корнях и питающие бактерий8. Ученые создали модифицированную агробактерию, в которой опухолеродные гены можно заменять любыми допустимыми по размеру ДНК-фрагментами, превращая вредоносный организм в мощный и безопасный инструмент доставки генов в клетки растений.
Один из самых интересных примеров доставки ДНК с помощью Agrobacterium – генетическая модификация риса для борьбы с дефицитом витамина A. Недостаток этого витамина считается главной предотвратимой причиной детской слепоты: ежегодно он отбирает зрение у 250–500 тысяч детей9. Почти половина этих детей умирает в течение года после потери зрения, что становится трагическим подтверждением важности витамина A для здоровья в целом. Наш организм получает витамин A из некоторых продуктов животного происхождения и производит из разных предшественников, в том числе из бета-каротина, который придает оранжевый цвет овощам вроде моркови и батата. Бета-каротина, однако, нет в рисе, который благодаря своей дешевизне и обилию на рынке служит основным продуктом питания во многих регионах, где распространен дефицит витамина А. Побеги риса вообще-то способны производить бета-каротин: он синтезируется в листьях, где участвует в фотосинтезе. Но соответствующие гены не экспрессируются в крахмалистых зернах, которые мы как раз и едим.
Чтобы решить эту проблему, ученые под руководством Инго Потрикуса из Швейцарской высшей технической школы и Петера Бейера из Фрайбургского университета в Германии создали «золотой рис»: добавив в геном обычного риса два гена – из нарцисса и бактерии – с работающим только в зернах промотором, они обеспечили синтез бета-каротина в съедобной части растения10. Над этим проектом работали несколько лет и об успехе объявили в 2000 году. Дальнейшие улучшения[63], проведенные уже совместно с биотехнологическим гигантом Syngenta, вылились в 23-кратное повышение количества бета-каротина в золотом рисе. Впоследствии Syngenta передала связанные с этим продуктом патенты, технологии и трансгенные семена населению нуждающихся в нем стран.
Клинические исследования показали, что желто-оранжевый рис безопасно и эффективно поставляет в организм человека бета-каротин, который преобразуется в витамин A11. Американское общество питания отметило, что «очень небольшое количество – возможно, чашка – золотого риса способно обеспечивать 50 % рекомендуемой суточной нормы потребления витамина A». Несмотря на это, внедрение золотого риса в аграрную практику идет исключительно медленно из-за противодействия всевозможных объединений противников генетически модифицированных организмов (ГМО)12. В последние годы, в частности, критика направлена не столько на само растение, полезность которого сложно отрицать, сколько на то, что выращивание такого риса даст зеленый свет внедрению других ГМ-продуктов; и вообще, лучше бы бедные получали витамин А из более богатого питательными веществами рациона. Но все же наметились некоторые подвижки. В 2019 году Бангладеш, где от дефицита витамина A страдает 21 % детей, первой из стран одобрила посев семян золотого риса13. На Филиппинах доля таких детей в возрастной категории от шести месяцев до пяти лет за период с 2008 по 2013 год выросла с 15 до 20 % – а это тысячи обреченных на слепоту и смерть. В 2019 году Филиппины, признав безопасность употребления золотого риса, подготовили фундамент для его возделывания[64]. Золотой рис появился 20 лет назад, но споры о нем, как и о других ГМ-культурах, не угасают по сей день, подпитываясь в некоторых случаях научными знаниями, в некоторых – сложными торгово-экономическими соображениями, а во многих – расплывчатыми представлениями и частными мнениями. И конечно, более свежие технологии открывают еще больший простор для дискуссий.
Итак, мы уже не один десяток лет умеем изменять геномы всевозможных организмов. Но описанные выше методы лишены притягательной простоты. Организм включает в себя новый ген лишь после серии проб и ошибок, и место, где он окажется, либо не контролируется вовсе – а это непредвиденно влияет на экспрессию, – либо контролируется умеренно, но ценой еще более трудоемкой инженерии. Когда мы задались целью внедрить ген инсулина или флуоресцентного репортера в бактерию или мышь, пытаться сделать это идеально, пожалуй, можно не раз и не два, но такая стратегия пригодна не везде, особенно если мы мечтаем о лечении генетических болезней человека. Нам хотелось бы придумать простой и точный способ редактировать геномы: находя специфические последовательности ДНК, либо заменять их нужными фрагментами собственного изготовления, либо просто аккуратно вырезать из генома. И теперь у нас такой способ есть. Я рассмотрю систему CRISPR/Cas9, однако, как это часто бывает с технологиями, почти одновременно появились несколько революционных методов геномного редактирования. Альтернативные варианты – нуклеазы на основе белков с доменом «цинковые пальцы» (ZFN) и нуклеазы на основе эффекторов, подобных активаторам транскрипции (TALEN), – не могут сравниться с CRISPR/Cas9 по скорости, дешевизне и простоте применения14. Я упоминаю их исключительно ради полноты картины и чтобы дать читателю представление об атмосфере начала XXI века, насыщенной семенами идей о редактировании генома, которые готовы были вот-вот прорасти.
CRISPR/Cas9 – очень древняя или, напротив, совсем новая техника. Ее, возможно, открыли, а возможно, изобрели. Любой из этих вариантов может оказаться верным в зависимости от ракурса. Сначала посмотрим, как этим геномным инструментом оперируют его исконные обладатели, а затем обратимся к его современным версиям на службе у человека.