{16}. Мы послали ее в FEBS Letters (журнал Федерации европейских биохимических обществ) – я был знаком с его редактором Джорджио Семенца, и он обещал ее быстро опубликовать. Вскоре нам удалось получить последовательность первого гена адреналинового нейротрансмиттерного рецептора мозга человека. Мы прекрасно понимали, что впереди у нас еще много работы – начиная с очистки рецепторных белков до разработки методики считывания кода, но чувствовали, что сделали нечто очень важное.
Увидеть своими глазами последовательность ДНК, которая до сих пор существовала лишь в воображении, было поразительно, – вроде как выйти на яркий солнечный свет из пещерной темноты. Даже сегодня мне кажется невероятным увидеть молекулярные коды с помощью столь несложной технологии. Та статья стала поворотным пунктом в моей карьере: вместе с командой единомышленников я вступил в новую область науки – молекулярную биологию. И мы были готовы совершить новый рывок.
Я понимал, что определение последовательности гена или белка – только первый шаг к пониманию того, как работает адреналин. Завершение этого этапа означало всего лишь начало следующих. Например, можно было внедрить ген рецептора человека в клетки мышей, культивировать их, начать массовое производство рецепторов и использовать их в самых различных экспериментах. Следовало получить намного больше последовательностей для продолжения работы над нашим открытием – ведь мы поняли, что различные рецепторы нейротрансмиттеров взаимодействуют с одним и тем же антителом. Чтобы подтвердить наше предположение об их общем эволюционном происхождении, нужно было сравнить последовательности большого числа рецепторов. Попытки прочитать ДНК нескольких рецепторных генов оказались первым, пусть и неосознанным, шагом в новую, тогда еще не существовавшую область науки – геномику.
Кардинальному повороту в моих исследованиях способствовала вышедшая в Nature статья группы ученых Калифорнийского технологического института (Калтех) под руководством Ли Гуда о замечательных возможностях новой технологии секвенирования ДНК. Четыре различные реакции секвенирования по Сенгеру проводились в одной дорожке на секвенирующем геле с помощью четырех различных флуоресцентных красителей. Двигаясь к нижней части геля, фрагмент ДНК попадал под лазерный луч, активирующий краситель. Светящиеся красители легко обнаружить с помощью фотоусилительной трубки и передать данные на компьютер. Появление четырех цветов, соответствующих четырем нуклеотидам, означало непосредственное прочтение генетического кода.
Раньше я уже работал с Ли Гудом и его постдоком Майклом Ханкапиллером над рецепторными белками, и теперь решил снова к ним обратиться. Потратив почти год на секвенирование методом радиоактивных меток, причем с весьма скудными результатами, я сразу оценил все преимущества технологии Калтеха, связался с авторами статьи и узнал, что Ханкапиллер вскоре возглавит работу по разработке промышленного секвенирования ДНК. Он перешел на работу в биотехнологическую компанию Applied Bio systems (ABI). Я поговорил с Ханкапиллером и местным представителем ABI с предложением купить одно из их первых устройств. Мое предложение заинтересовало ABI, поскольку сам факт приобретения НИЗ этих приборов именно у ABI мог бы поднять престиж компании и сделать рекламу их технологии. После долгих переговоров все было согласовано, и моя лаборатория готовилась стать полигоном для испытания нового метода секвенирования. Дело было только за суммой в 110 тысяч долларов, чтобы заплатить за секвенатор. Однако завотделом фундаментальных исследований НИЗ Эрнст Фриз был против покупки неапробированной технологии, и вместо этого предложил мне 250 тысяч долларов на покупку секвенатора белка.
Мы с Фризом поспорили о сравнительных достоинствах секвенирования белка и секвенирования ДНК, и я проиграл. Я был в полном отчаянии, но через несколько дней вспомнил про специальный счет на 250 тысяч долларов от Министерства обороны для идентификации химического оружия и заявил Фризу о своей решимости опробовать новое устройство, воспользовавшись этими деньгами. Моя решительность произвела на него впечатление, и заказ на секвенатор был отправлен в ABI.
И в феврале 1987 года новое устройство для секвенирования ДНК доставили по адресу «НИЗ, корпус 36». В этом контейнере находилось мое будущее. Я носился с этим прибором, как с ребенком. В лаборатории было мало места, и я велел поставить секвенатор в свой кабинет. Моей сотруднице Жанин Гокейн не хватало уверенности в собственных силах, но я верил в ее способности и попросил помочь запустить новый прибор.
Самой важной его частью была электрофорезная камера с вертикальным гелем для секвенирования, размером с блокнот. В геле было 16 дорожек для одновременного запуска 16 образцов. (Требовалось еще прогнать 4 стандарта, чтобы убедиться в правильном функционировании устройства, оно могло справиться лишь с дюжиной образцов.) В нижней части геля находился сканер, который двигался взад-вперед, передавая сигналы от флуоресцентных красителей в компьютер. Один проход занимал 16 часов и выдавал данные, на получение которых старым методом ушла бы неделя.
Потратив еще несколько недель на исправление технических неполадок, мы начали получать прекрасные результаты, до двух сотен пар оснований генетического кода с каждого образца ДНК. Проблема состояла лишь в том, что программное обеспечение прибора было примитивным и ненадежным. Позднее наши программисты потратили немало времени на усовершенствование компьютера.
На ключевом этапе процесса секвенирования мы использовали ДНК-полимеразу. Это фермент, который копирует ДНК с помощью небольшого фрагмента ДНК – праймера для секвенирования. Чтобы понять, как работают полимераза и праймер, представим процесс ремонта поврежденных железнодорожных путей, где на определенном участке удален один рельс. Железнодорожные пути – это двойная спираль ДНК, а ремонтная бригада – ДНК-полимераза, и вот она начинает укладывать новые пути с того места, где было два нетронутых рельса. ДНК-полимеразу можно обмануть и заставить начать с определенной точки на ДНК с помощью короткого кусочка синтетической ДНК (праймера), который связывается с определенными основаниями для создания короткого отрезка двойной спирали ДНК.
Еще будучи стажером, я научился у Ната Каплана проверять чистоту и количество реагентов, не доверяя гарантиям поставщиков. Запуская прибор, я каждый раз измерял количество ДНК и секвенирующего праймера, чтобы получить правильное соотношение между реагентами и продуктами химической реакции. Такое внимание к деталям оказалось чрезвычайно важным: представители ABI заявили, что до нас никто так не интерпретировал результаты секвенирования, да и вообще не получал приличные данные. Большинство их клиентов были настолько разочарованы, что вернули секвенаторы ABI. А мы достигли существенного успеха с помощью этого устройства и сумели использовать его для секвенирования двух рецепторных генов из сердца крысы – генов бета-адренергетического рецептора, изменяющего активность сердцебиения в ответ на введение адреналина, и мускаринового рецептора, который замедляет частоту сердечных сокращений под влиянием блуждающего нерва. Мы быстро секвенировали оба гена, а для сравнения выполнили секвенирование некоторого количества генов вручную методом Сенгера. Осенью 1987 года мы опубликовали результаты нашей работы в PNAS, и они стали первыми данными, полученными методом автоматизированного секвенирования ДНК – тем самым методом, о котором я прочитал в журнале Nature всего год назад{17}. Направление моих исследований изменилось бесповоротно и навсегда.
После клонирования, секвенирования и выделения адреналинового рецептора мы приступили к определению его структуры и функций методами молекулярной биологии. Каким образом он распознает адреналин? Что происходит после связывания рецептора с адреналином? Что на самом деле делает молекула рецептора? Что контролирует синтез и распад рецептора? Какова молекулярная структура рецептора в мембранах наших клеток?
Основой решения этих задач стало установление трехмерной структуры рецепторного белка в клеточной мембране. Пространственная структура белка не однозначно определяется последовательностью ДНК, и установление этой структуры остается одной из великих задач биологии. Очень важно выяснить, как одна из огромного числа молекул, беспорядочно перемещающихся в наших клетках, приобретает правильную форму и правильный заряд для присоединения к рецептору и вызывает жизненно важные реакции – например, учащение сокращений сердца или замедление роста клеток.
Все занимавшиеся исследованием структуры молекулы адреналинового рецептора непременно отмечали ее ключевую особенность: наличие 7 участков аминокислот, согласно компьютерному моделированию, располагающихся в форме штопора или альфа-спирали. Эти спирали чаще всего встроены в липидные мембраны клеток. Напомним, что рецепторные молекулы являются основным средством связи между внешней поверхностью клетки и ее содержимым, – это много лет назад показали мои эксперименты со стеклянными бусинами. Адреналиновый рецептор встроен в мембрану так, что эти семь «пальцев» образуют нечто вроде кармана для захвата адреналина и таким образом изменяют остальную часть молекулы рецептора, «объявляя» о появлении химического мессенджера. Среда вне липидной мембраны представляет собой водный раствор, поэтому мы полагали, что соединенные с адреналином аминокислоты рецептора должны быть гидрофильными, а также отрицательно заряженными, так как часть молекулы адреналина несет положительный заряд. И мы действительно нашли несколько аминокислот с такими свойствами. Другие аминокислоты последовательности рецепторного белка, например пролин, обычно играют важную роль в построении его структуры, образуя своеобразные изгибы.