Уорреном, собравшим библиотеку космидных клонов – участков ДНК человека длиной около 30 тысяч пар оснований, многократно перекрывающих Xq28. Уоррен присоединился к этой работе вместе с Энтони Каррано, директором проекта расшифровки генома человека в Ливерморской национальной лаборатории Министерства энергетики. Наша цель состояла в секвенировании Х-хромосомы в течение 10–12 лет, а истинной сутью предложения был план секвенирования 4,2 миллиона пар оснований Xq28 за три года, с одновременным снижением стоимости секвенирования одной пары оснований с 3,50 до 0,60 долларов. (Сегодня наши затраты составляют 0,0009 долларов за одно основание.)
Затем я получил письмо с сообщением, что собеседование с претендентами запланировано на 29 марта 1990 года в отеле «Марриот» в Арлингтоне, штат Вирджиния. В Национальном центре исследования генома человека, как он тогда назывался, был особый Комитет по рассмотрению заявок на гранты, состоявший из большого ряда ученых, которые хотели играть главную роль в будущем секвенировании генома. Среди них были Барт Г. Баррелл из Кембриджа, Рональд Дэвис из Стэнфорда, Глен Эванс из Института Солка, Томас Марр из Лаборатории в Колд-Спринг-Харборе, Ричард М. Майерс из Калифорнийского университета в Сан-Франциско, Брюс Роу из Университета Оклахомы и Ф. Уильям Стадьер из Брукхейвенской национальной лаборатории. Центр генома Уотсона представляла Джейн Петерсон.
В течение ряда лет после этой тягостной встречи практически все члены Комитета подавали заявки от своих центров на секвенирование генома. Оценивая эти события с позиций сегодняшнего дня, я ясно понимаю, что тогда они явно объединилась ради одной-единственной цели – не позволить никому опередить их в получении денег. В ходе обсуждения члены Комитета заявили, что наша технология недостаточно разработана, картирование недостаточно подробно, и главное – у нас нет новых идей. Перед возвращением в Техас Том Каски сказал мне, что это был самый унизительный эпизод в его научной карьере.
Позже я узнал, что Комитет отдал первенство двум моим соперникам. Одним из них был Ли Гуд, планировавший секвенировать Т-клеточный рецептор, важнейшую часть иммунной системы человека, а другим – Уолли Гилберт, предложивший впервые секвенировать геном живого организма, микроорганизма Mycoplasma capricolium, вызывающего пневмонию у овец и коз. Примечательно, что он хотел использовать некий новый метод, не имея никаких данных о его эффективности.
Уотсон, огорченный принятыми Комитетом решениями не меньше меня, был готов организовать пересмотр заявок, если я выступлю еще раз. Следующие нескольких месяцев мы вели переговоры, уточняя содержание нового проекта, и предложили дополнительно исследовать другие хромосомы. Один из постдоков в моей лаборатории, Ивен Киркнесс, охотился за различными рецепторами нейромедиатора гамма-аминомасляная кислота (ГАМК). Он выделил новый рецептор на хромосоме 15 в середине участка, отвечающего за два генетических заболевания – синдромы Эйнджелмена и Прадера-Вилли. Эти необычные заболевания были описаны лишь в конце 1980-х годов, когда ученые впервые поняли, что в зависимости от своего происхождения гены проявляются по-разному: импринтинговый ген материнской хромосомы может влиять на одни процессы, а тот же ген на хромосоме отца – на другие. Синдром Прадера-Вилли проявляется в умственной отсталости, ожирении и аномалиях роста, он возникает у людей, которые наследуют обе копии хромосомы 15 от своей матери, а не по одной от каждого родителя. Синдром Эйнджелмена характеризуется умственной отсталостью, характерным судорожным движениями и эпилепсией. Марк Лаланд из детской больницы в Бостоне, изучавший явление импринтинга, был очень заинтересован в секвенировании этого участка и пообещал работать вместе с нами. Кроме того, я добавил к проекту изучение участков хромосом, ответственных за болезнь Хантингтона. Дефектный ген, ответственный за эти неврологические расстройства, был картирован на конце короткого плеча хромосомы 4 около 8 лет назад, но сам ген еще не был определен, хотя усилиями Нэнси Векслер большой коллектив ученых – около 60 человек из 6 разных групп – объединились именно с этой целью. У Нэнси была личная заинтересованность в этом проекте: она и ее сестра находились в группе риска, так как их мать, дяди и дед по материнской линии умерли от этого наследственного, неизлечимого и смертельного заболевания головного мозга. Чтобы ей помочь, ученые испробовали все методы – за исключением секвенирования.
Часть этих исследователей утверждали, что секвенирование – непроверенный метод, который вряд ли будет работать, другие беспокоились, что на эту работу уйдут все ресурсы их собственных проектов. Я же говорил, что у меня есть независимые фонды в НИЗ и терять им нечего. Однако никого из них геномные задачи не интересовали. Я лишний раз убедился, что многие исследователи генома человека были гораздо больше озабочены выигрышем гонки за обнаружение генов каких-либо заболеваний. У меня сложилось впечатление, что и охотники за геном болезни Хантингтона – не исключение. Они гнались лишь за славой, и их совершенно не интересовали новые идеи, которые могут ускорить обнаружение гена. По понятным причинам исключением была сама Нэнси, которая, как и любой другой человек, оказавшийся под угрозой страшного заболевания, была готова сделать все возможное, чтобы найти дефектный ген, причинивший столько страданий ее семье. Нэнси вмешалась в обсуждение и настояла, чтобы эта группа исследователей начала со мной работать. Ни у кого не нашлось убедительных аргументов против, и было решено, что Джеймс Гузелла из Центральной больницы штата Массачусетс предоставит моей команде под руководством Дика Маккомби 3 клона, содержащие 100 тысяч пар оснований на конце хромосомы 4. Как оказалось, клоны были на периферии целевого участка, где предположительно находился ген. Я принял это предложение, так как передо мной стояла более серьезная цель – наладить процесс быстрого секвенирования ДНК и доказать эффективность моего метода. Я понимал, что если мне удастся установить рабочие отношения с группой исследователей болезни Хантингтона, то в случае успешного секвенирования они смогут предоставить мне более перспективные клоны.
Другим объектом исследования было расстройство, вызванное мышечной атрофией, – миотоническая дистрофия. С учеными, исследующими это заболевание под руководством Тони Каррано, моим соперником в борьбе за злополучный грант на исследование Х-хромосомы, мне повезло больше. После подписания соглашения, согласно которому я обязался делиться с ним полученными данными и взять его в соавторы, мы получили 3 клона из хромосомы 19, содержащие 100 тысяч пар оснований на участке, наиболее вероятно включавшем искомый ген. Постдок из Испании Антония Мартин-Гальярдо возглавила команду исследователей хромосомы 19, которую я финансировал из своего внутриинститутского бюджета. Я полагал и тогда, и сегодня, что успех – лучший способ в борьбе с критиками. Хорошие результаты всегда побеждают.
С применением метода дробовика секвенирование пошло быстро. Клоны в виде космид ДНК длиной около 35 тысяч пар оснований были упакованы в фаги и внедрены в E. coli. Вначале мы использовали акустические волны, чтобы раздробить множество копий ДНК на мелкие фрагменты размером около полутора тысяч пар оснований. Случайным образом отобрав 1000 фрагментов и секвенируя от 300 до 400 пар оснований генетического кода в каждом, мы теоретически должны были охватить все пары оснований ДНК в космиде минимум десять раз (350 × 1000 = 350 000).
Но и тут нас ждали трудности. Программное обеспечение тогда не предназначалось для обработки более нескольких сотен последовательностей, поэтому было невозможно справиться с тысячами, и нам пришлось прибегнуть к утомительному ручному методу. Для сколько-нибудь существенного прогресса требовались гораздо более мощные компьютеры, чем наши, и программное обеспечение значительно более высокого качества (несмотря на противоположное мнение наших коллег). И я стал нанимать на работу специалистов по информационным технологиям.
Одним из них был Марк Адамс из Мичиганского университета, вылитый Маколей Калкин (из кинофильма «Один дома»), имевший вид «нет-ничего-невозможного», исполнительный и энергичный парень в больших очках, с которым я провел собеседование в конце 1989 года. Меня поразило тогда, что этот худой молодой человек создал компанию по разработке программного обеспечения, еще учась в аспирантуре. Марк увлекался геномикой и был готов приступить к работе. Мы приобрели мощные компьютеры компании Sun, а я разыскал программистов для разработки новых способов интерпретации генетического кода, данные о котором у нас уже начали накапливаться. Благодаря незрячему программисту Марку Дабнику, который пользовался клавиатурой особой системы, «разговаривавшей» с ним в таком быстром темпе, что никто другой не мог ничего разобрать, мы стали по-новому смотреть на ДНК. Мы даже попытались использовать ее для прочтения генетического кода, проигрывая его в виде музыкальной фразы и надеясь обнаружить изменения в генетической структуре.
Но что бы мы ни делали, правильная интерпретация генетического кода оказалась практически невозможной даже после составления длинных отрезков хромосом. Программное обеспечение, с помощью которого можно идентифицировать последовательности бактерий, не работает в случае более сложного человеческого генома. В нем гены разбиты на небольшие сегменты (экзоны) бессмысленными участками ДНК (интронами), подобно тому, как бессмысленная реклама прерывает телефильм. Поэтому ген часто состоит из частичек и кусочков огромного генетического кода, от сотен тысяч до миллионов пар оснований. Мы использовали самые совершенные программы, чтобы найти эти участки, но компьютер не мог отличить реальные гены от шума, генерируемого случайным сочетанием четырех букв замучившего нас генетического кода.
И тогда я придумал новый способ определить прогнозируемый ген, отыскав его аналог в матричной РНК. Всякий раз, когда в геноме человека обнаруживается реально действующий ген, мы находим и соответствующую молекулу матричной РНК, сокращенный вариант гена, который содержит только пары оснований генетического кода для создания белка. Превращая эту «летучую» РНК в кДНК для последующего секвенирования, мы обрели способ подтвердить наличие прогнозируемых генов.