Для проведения анализа ученые должны были начинать с определенной области ДНК, которая, по их мнению, могла быть полезной. Анализ седьмой хромосомы Коллинз и Цуй начали с области, в которой Цуй нашел одинаковые мутации в некодирующей ДНК семей с муковисцидозом. Они знали, что это не тот ген, за которым они охотились, но полагали, что тот ген находился поблизости, что эти две области взаимосвязаны. Цуй смог найти эту некодирующую область, потому что она была значительно больше, чем части хромосомы, которые кодируют белки. Но она также была просто хромосомной ерундой, цепочками повторяющихся пар оснований, которые в семьях с муковисцидозом были другими.
Тем не менее отсюда можно было начинать. И с этой отправной точки Коллинз и Цуй начали «ходить» по ДНК, отрезая от нее кусочки с разными интервалами, а затем анализируя пары оснований в каждом сегменте. Поскольку каждый раз они отрезали одинаковый кусок от большой ДНК в разных местах, в анализируемом коде присутствовали перекрывающие друг друга последовательности, которые они могли использовать для того, чтобы снова соединить всю цепочку в правильном порядке. Например, один участок ДНК может иметь последовательность АЦТЦАГ в конце анализируемого сегмента, в то время как другой сегмент может иметь такую же последовательность, АЦТЦАГ, в начале. Тогда эти две части можно совместить, чтобы получить последовательность большего фрагмента ДНК.
«Пройдясь» по одной области они «перепрыгивали» на другую часть хромосомы и делали там то же самое, отрезали в разных местах, определяли, какие пары оснований были в тех фрагментах, а затем снова собирали всю головоломку, сопоставляя перекрывающиеся последовательности, на этот раз вставляя также и ту часть, через которую они перепрыгнули.
Используя этот метод прогулок и прыжков, Коллинз и Цуй постепенно реконструировали генетический материал на седьмой хромосоме, особенно на участке, который Цуй идентифицировал ранее. Они использовали этот метод не только на генетическом материале людей с муковисцидозом, но и на генах людей из семей без муковисцидоза для сравнения, в поисках любых различий, которые могли бы быть значимыми.
Иголку в стоге сена было трудно найти. При некоторых генетических заболеваниях в хромосоме могут отсутствовать тысячи пар оснований (большие делеции), и, разумеется, если отсутствуют тысячи пар оснований, ошибку найти легче, чем когда отсутствует всего одна пара. Неправильно функционирующий белок муковисцидоза явно вызывала небольшая делеция. Однако постепенно, кропотливо разрезая, анализируя и снова собирая фрагменты воедино, ученые начали складывать головоломку.
Коллинз и Цуй получили ответ на научной конференции в мае 1989 г. в Йельском университете в Нью-Хейвене, штат Коннектикут. Каждый вечер двое ученых возвращались в свое общежитие и просматривали факсы результатов анализа пар оснований, выполненного за день в лаборатории. Однажды дождливым вечером они подняли с пола скрученный лист распечатки с факса и нашли на нем ответ. Сравнение пар оснований в очень специфической области седьмой хромосомы показало отсутствие трех пар оснований у пораженных муковисцидозом, Ц, Т и еще одной Т. Все, кто не страдал муковисцидозом, имели эти три пары оснований в той области. Три отсутствующие пары оснований были в хромосоме, которую, как окажется, составляли 188 702 пары оснований. При кодировании белка этой хромосомой в состав белка не попадает одна-единственная аминокислота из 1480, белок складывается неправильно, неправильно регулирует содержание воды и электролитов, и результат – муковисцидоз. Вполне очевидно, они нашли искомый дефект и искомый ген{274}.
Затем, чтобы выполнить данное себе обещание, они вернулись в Торонто и откупорили бутылку канадского виски, чтобы отпраздновать. Лаборант, которого они попросили сфотографировать их исторический тост, счел странным, что старшие коллеги выпивали крепкое спиртное в десять утра, но их улыбающиеся лица на фоне стопок медицинских журналов выражали полнейший восторг. Это знаменательное открытие вселило надежду во всех связанных с муковисцидозом людей. Доктору Коллинзу передали запись, которую один 8-летний пациент с муковисцидозом сделал в дневнике в день, когда было объявлено об открытии: «Севодня самый лучайший день в моей жизни. Нашли ген от мукависидоза»{275}.
Открытие гена, ответственного за муковисцидоз, связано с работой, проделанной в начале 1980-х гг., когда изучали, что именно на клеточном уровне вызывает проблемы со слизью в легких. Доктор Пол Куинтон был одним из ученых, выполнявших эту работу. Пол страдал от кашля и легочных инфекций все свое детство, которое он провел на юго-востоке Техаса в 1950-х гг. Не получая ответа от врачей, которые наблюдали его, он провел собственное исследование и натолкнулся на возможный диагноз муковисцидоза. Он рассказал о своей гипотезе врачу-пульмонологу в Хьюстоне. Врач увидел мудрость в понимании этого 19-летнего юноши и выполнил потовую пробу, которая подтвердила диагноз «муковисцидоз». Когда Пол спросил его, сколько ему осталось жить, врач-пульмонолог честно ответил ему, что понятия не имеет и что, строго говоря, он уже должен быть мертв.
Пол воспринял откровенность доктора серьезно и углубился в исследования, сначала получив докторскую степень в Университете Райса, а затем пройдя стажировку в Университете Калифорнии в Лос-Анджелесе. Здесь его интерес к физиологии слился с желанием выяснить, какой клеточный дефект является причиной его собственной болезни.
Когда доктор Куинтон начинал свою научную работу в 1970-х гг., было известно, что в клетках больных муковисцидозом происходит что-то неправильное. В то время преобладало мнение, что какой-то фактор в крови больных муковисцидозом вызывал нарушения электролитического состава и баланса жидкости, наблюдаемые в пострадавших органах, таких как легкие, поджелудочная железа и кожа. Поскольку соленая кожа является явным признаком муковисцидоза, доктор Куинтон решил, что будет логичным начать с нее, поэтому он начал изучать движение натрия и хлоридов, двух веществ, составляющих соль, в нормальных клетках и клетках у пациентов с муковисцидозом.
Он начал изучать клетки в ткани легких больных муковисцидозом, но эффективное исследование стало невозможным – ткань слишком сильно зарубцована. Он решил сосредоточиться на потовых железах, которые функционировали неправильно, но не имели рубцовой ткани и патологических изменений. В качестве контроля он использовал отходы кожи при пересадке волос у мужчин среднего возраста. Для потовых желез больных муковисцидозом он брал образцы кожи у местных больных и у себя – шрамы на его руках сегодня показывают, откуда были взяты фрагменты ткани. Результатом проведенных им экспериментов стала статья, опубликованная в 1983 г. в журнале Science, в которой было показано, что клетки в потовых железах больных муковисцидозом плохо выводили хлорид. Статья также демонстрировала, что эта дисфункция была вызвана не дефектом крови, а скорее дефектом проницаемости хлоридного канала клетки{276}.
Исследования Цуй, Коллинза, Куинтона и других в конечном счете связаны, а последующая история завершила цепочку причинно-следственных связей от гена к белку и к болезни. Потеря трех пар оснований в генетическом коде приводит к тому, что в белке отсутствует одна аминокислота, в результате чего белок складывается неправильно. Белок, называемый регулятором трансмембранной проводимости при муковисцидозе (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator – CFTR), обычно перемещается наверх клетки и позволяет хлориду выходить наружу. Когда эта система нарушается, хлорид оказывается заперт внутри клетки, а отрицательно заряженный хлорид притягивает положительно заряженный натрий. Поскольку натрий и хлорид связываются с образованием соли, далее в клетку по закону осмоса затягивается вода. Без смазки из соли и воды на поверхности клетки слизь высыхает и загустевает, а за этим следуют бактерии, воспаление и болезнь.
К середине 1990-х гг. биохимическая часть истории муковисцидоза была хорошо изучена и потенциальный путь вперед также казался ясным. Новая технология – перенос с помощью вирусного вектора – обещала быстрое излечение с помощью генной терапии. Некоторые вирусы вставляют свой генетический материал (в виде ДНК или РНК) в ДНК хозяина, а затем используют клеточный механизм хозяина, чтобы транскрибировать свою ДНК в белки, которые им нужны, чтобы создавать свои копии. Самостоятельно размножаться они не могут, но у них есть миллионы лет опыта эксплуатации клеток других существ, в том числе людей. На самом деле около 8 % нашей ДНК – это вирусная ДНК, оставшаяся у нас навсегда{277}. В случае муковисцидоза исследователи предложили загрузить копию нормального гена муковисцидоза в ДНК вируса, а затем позволить вирусу выполнить сложную работу по введению этого функционирующего гена в ДНК пациента.
Проблема заключалась в том, что, хотя вирусы действительно уже давно вставляют свой генетический материал в нашу ДНК и при определенных обстоятельствах делают это очень успешно, наша иммунная система борется с этим вторжением в течение столь же длительного времени. Для генной терапии при муковисцидозе загрузка нормального гена муковисцидоза в вирус не была проблемой. Проблема была в том, чтобы выяснить, как обойти иммунную защиту организма и заставить вирус доставить нормальную копию гена муковисцидоза в клетки легкого. Не удавалось, и до сих пор не удалось определить точные условия, необходимые для передачи гена.
Неудача с генной терапией в 1990-х гг. стала огромным ударом для пациентов, их семей и Фонда по борьбе с муковисцидозом. Когда в 1989 г. ген-виновник был найден, все начали думать, что средство исцеления уже не за горами. Но, как и раньше, Фонд по борьбе с муковисцидозом собрался с силами и подумал о следующем большом шаге, который они собирались сделать, о следующем большом риске, на который они собирались пойти. Их решимость приведет туда, где не «ступала» ни одна болезнь.