дифосфат. В митохондриях происходит «подзарядка» – к АДФ вновь присоединяется фосфатная группа. Но к нашему рассказу все это не имеет прямого отношения. Для нас важно другое: митохондрии имеют свою собственную ДНК. Более того, митохондрии располагают своей собственной РНК-полимеразой, которая снимает мРНКовую копию с митохондриальной ДНК! Но и это не все. В митохондриях есть свои рибосомы, свой собственный аппарат белкового синтеза. Это уже совсем странно – ведь в той же цитоплазме масса нормальных клеточных рибосом. Но на этих рибосомах синтезируется белок только с мРНКовых копий ядерной ДНК. Митохондрии ими пользоваться почему-то не желают.
У митохондрии все – малого размера. Мини-рибосомы, мини-РНК-полимераза, мини-ДНК. И вроде бы это понятно – ведь митохондрия, разумеется, гораздо меньше клетки. Но умение самостоятельно строить белок вовсе не означает, что митохондрия – это автономная часть клетки, не зависящая от ядерной ДНК. ДНК митохондрии столь мала по размеру (она содержит всего около 15 тысяч пар оснований), что на ней никак не может уместиться вся информация о молекулах белков, необходимая для автономного существования митохондрий. Большая часть этой информации находится в ядре клетки, т. е. записана в виде последовательности нуклеотидов в ядерной ДНК. И вот ко всем странностям митохондрий добавилась еще одна, самая удивительная – у митохондрий свой собственный генетический код.
Обнаружилось все это, по-видимому, случайно. Б. Берелл и его сотрудники из Лаборатории молекулярной биологии в Кембридже (Англия) занимались расшифровкой последовательности митохондриальной ДНК человека. Кстати, это тот самый Берелл, который обнаружил впервые, что гены могут налезать друг на друга. Сравнили последовательность гена, кодирующего одну из субъединиц цитохромоксидазы, с белковой последовательностью, правда, не человеческой, а бычьей цитохромоксидазы. Последнее обстоятельство не помешало совершенно точно определить код митохондрий человека. Он изображен на рис. 18. Видно, что этот код в целом похож на код, уже известный ранее. Но четыре кодона изменили свой смысл. Кодон УГА отвечает триптофану, АУА – метионину, а кодоны АГА и АГГ стали терминирующими. Но на этом чудеса не закончились. Когда сравнили последовательности ДНК и белков у дрожжевых митохондрий, то оказалось, что у них код и не такой, как обычно, и не такой, как у митохондрий человека. К тем изменениям, которые имеются у кода митохондрий человека, добавилось еще такое: все четыре лейциновых кодона, начинающихся с ЦУ, перешли к треонину. Треонину стало отвечать восемь кодонов! У лейцина осталось только два: УУА и УУГ. Правда, кодоны АГА и АГГ вернулись к Арг, как в «универсальном» коде.
Рис. 18. Код митохондрий. Такой код имеют митохондрии человека. У митохондрий дрожжей кодоны, начинающиеся с ЦУ, кодируют треонин, а кодоны АГА и АГГ отвечают Apr. Стрелками указаны те места, в которых код митохондрий человека отличается от «универсального» кода, приведенного на рис. 7
Как же оценивать эти открытия? Безусловно, возможны разные трактовки. С одной стороны, можно сказать, что, собственно, ничего особенного и не произошло. Если бы сразу в процессе расшифровки были обнаружены маленькие вариации в коде, то они не вызвали бы большого удивления. Но, с другой стороны, шутка ли сказать, обнаружилось, что в одной клетке, причем в нашей собственной, человеческой клетке, сосуществуют два разных кода! Нет, открытие новых кодов не следует недооценивать. Ведь получены четкие доказательства того, что код эволюционировал, что он не сразу возник таким, каким мы его видим теперь.
Помните, когда генетический код обсуждался в главе 2, было сформулировано правило, которому универсальный код отвечает почти строго: не важно, какое из двух пуриновых оснований или какой из двух пиримидов находится в третьем положении кодона. А теперь взгляните опять на рис. 18. Код митохондрий человека и есть такой «идеальный» код, в котором это правило выполняется совершенно строго! Кстати, то же относится и к коду митохондрий дрожжей.
Неоднократно высказывалась точка зрения, что митохондрия – это остатки бактерии, очень давно образовавшей симбиоз с эукариотической клеткой. То, что у митохондрии даже код другой, служит еще одним очень веским доводом в пользу такого предположения. Быть может, у всех клеток был такой же код, как у нынешних митохондрий человека, а затем в коде произошли небольшие изменения. И, может быть, далеко не все живое на Земле произошло от клеток с уже изменившимся кодом? Может быть, часть видов – это прямые потомки древних клеток, имевших митохондриальный, «идеальный» код? А может быть, есть виды, которые эволюционировали от клеток, получившихся после каких-то других, пусть небольших, изменений «идеального» кода?
Но более привлекательным представляется другое объяснение того, что митохондрии имеют свой особый код. Согласно этой точке зрения, коды митохондрий не более древние, а наоборот, более молодые, чем основной код, и возникли, когда большая часть митохондриальных генов уже «утекла» в ядро. В митохондриальной ДНК осталось так мало генов, что изменение кода перестало быть обязательно смертельным событием для митохондрии и клетки в целом. После того, как такое изменение произошло из-за мутации в аппарате синтеза белка в митохондриях, в структурных генах произошли мутации, компенсирующие эти изменения кода. После этого процесс утечки генов из митохондрий в ядро прекратился, так как аппарат синтеза белка митохондрий не мог уже быть подменен аппаратом клетки. Эта гипотеза привлекательна тем, что объясняет, почему передача генов из митохондрий в ядро остановилась на полдороге.
Эра ДНКовых последовательностей
Изобретение Сэнгером в середине 1970-х годов метода секвенирования ДНК оказалось важнейшей вехой на пути создания базы данных о последовательностях ДНК всевозможных организмов. Но как раз в отношении создания таких баз данных это изобретение опередило свое время. Ведь тогда еще не был доступен Интернет, а без Интернета создание и использование базы данных о последовательностях ДНК практически немыслимо. Так что первые десять лет накопление знаний о различных геномах шло медленно, хотя и были сделаны важнейшие открытия, о которых мы говорили выше в этой главе и еще будем говорить в главе 6. Кроме Интернета, важнейшим изобретением, резко ускорившим и упростившим создание геномных баз данных, был метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который позволил амплифицировать, т. е. многократно приумножать любые выбранные участки генома. Но метод ПЦР заслуживает особого разговора, собственно, с него началась биотехнологическая революция, и мы о нем подробно поговорим в главе 10.
Метод Сэнгера позволяет секвенировать куски ДНК, содержащие около 1000 нуклеотидов, но они, конечно, гораздо короче геномной ДНК. Как же секвенировать целый геном, содержащий, в случае человеческого генома, 3 миллиарда нуклеотидов? Понятно, что геномную ДНК надо нарезать на короткие куски. Слава богу, у нас есть такой сверхточный инструмент: рестиктазы (см. главу 4). Итак, используя какую-нибудь рестриктазу или смесь двух рестриктаз, если хотим, чтобы куски были покороче, нарезаем ДНК на куски (рис. 19). Прекрасно, теперь можно прочесть каждый кусок методом Сэнгера. Но постойте, для метода Сэнгера нужен праймер. Откуда же нам знать, какой праймер использовать, ведь мы еще ничего не знаем о последовательности кусков? Как же быть? А очень просто. Ведь после действия рестриктазы у фрагментов, как правило, образуются «липкие концы». Например, после разрезания ДНК рестриктазой EcoRI образуются два взаимно комплементарных конца:
Но эти концы одинаковые, так что если мы сделаем на ДНК-синтезаторе такую искусственную молекулу:
то она прилипнет к обоим концам, образовавшимся под действием рестриктазы. Правда, в обоих случаях между нашей синтетической молекулой, которая называются адаптером, и куском неизвестной пока ДНК имеются два однонитевых разрыва, но это не беда: они легко залечиваются ферментом ДНК-лигазой. Теперь все наши фрагменты, полученные после нарезания геномной ДНК, оказываются снабженными по концам прекрасно известной нам последовательностью, ведь мы ее сами выдумали, когда делали дизайн адаптеров: все 20 нуклеотидов слева от концевого Г в верхней цепи адаптера я выдумал сам, совершенно произвольно. Так что теперь нет никакой проблемы с дизайном праймеров для чтения последовательностей кусков геномной ДНК методом Сэнгера. Снабженные адаптером фрагменты разделяются с помощью гель-электрофореза или каким-нибудь другим способом (рис. 19), а затем секвенируются.
Рис. 19. Секвенирование генома. Вся геномная ДНК подвергается разрезанию на фрагменты рестриктазой (то же самое повторяется с использованием другой рестриктазы, чтобы в дальнейшем на последней стадии провести сборку всей последовательности по перекрывающимся участкам фрагментов, полученных при разрезании разными рестриктазами). Рестрикционные фрагменты соединяются с синтетическими адаптерами, как объяснено в тексте, с использованием «липких» концов, создаваемых рестриктазой. Затем фрагменты разделяются, и каждый фрагмент отдельно секвенируется, после чего следует сборка всего генома
Итак, мы секвенировали все куски, на которые была порезана геномная ДНК рестриктазой EcoRI. Дело в шляпе? Не тут-то было! Мы же не знаем, в каком порядке расположены куски вдоль генома. Как их теперь правильно собрать? К сожалению, нет другого способа, как повторить все сначала, используя другую рестриктазу. Тогда мы получим другое разрезание и по перекрывающимся участкам сможем узнать, какой кусок, полученный с помощью первой рестриктазы, следует за куском, полученным с помощью второй рестриктазы (рис. 19). Конечно, такая сборка полной последовательности делается компьютером. Но повторное секвенирование так и так надо делать, чтобы избежать случайных ошибок, ведь, как бы ни была хороша ДНК-полимераза, она редко, но ошибается. В реальности, чтобы получить последовательность генома с очень малым количеством ошибок, всю процедуру повторяют 10 раз.