Скорее всего, Кари Мулис не читал статью Кораны. Мулис работал в одной из биотехнологических компаний, которые стали расти как грибы после дождя в конце 1970-х и в начале 1980-х годов. Работая в биотехе, а не в научном институте, Мулис ясно осознавал, что возможность размножать ДНК в пробирке может привести к подлинной революции в биотехнологии. Он был настолько захвачен идеей о ПЦР, что ему удалось заразить своим энтузиазмом коллег по компании и убедить их поставить опыты. Схема их первых опытов показана на рис. 44.
Прежде всего выбиралась ДНКовая мишень для размножения. Необходимо было знать последовательность оснований в выбранной мишени, по крайней мере концевые последовательности. Затем синтезировали два праймера. Один из них был комплементарен нижней цепи ДНК на левом конце мишени; второй был комплементарен верхней цепи ДНК на правом конце мишени. Оба праймера примешали к образцу в большом избытке по отношению к ДНК-мишени. (ПЦР может быть осуществлена, даже когда в образце исходно находится одна молекула ДНК-мишени.) Также в образце находились в достаточном количестве все четыре дНТФ. После этого образец нагревался до температуры, гарантировавшей плавление ДНК-мишени (т. е. разделение комплементарных цепей). Затем образец вновь охлаждали. В ходе охлаждения синтетические праймеры связывались с комплементарными участками на разделенных цепях мишени, в то время как взаимно комплементарные цепи исходной ДНК-мишени не могли найти друг друга, так как они присутствовали в образце в ничтожно низкой концентрации.
Итак, в результате охлаждения получились два субстрата для реакции удлинения праймера (см. главы 5 и 7). Следовательно, добавление к образцу ДНК-полимеразы I приводило к удлинению двух праймеров навстречу друг другу. Так появлялись две дочерние молекулы. Они частично состояли из двух цепей, но содержали длинные одноцепочечные хвосты. Существенно, что последовательность-мишень была полностью двухцепочечной. Последующие циклы нагревания / охлаждения / добавления полимеразы приводили к синтезу все новых молекул, и у всех них участок-мишень был двухцепочечным.
Как видно из рис. 44, молекулы, состоящие исключительно из последовательности-мишени, появляются только в третьем цикле. В ходе дальнейших циклов их количество растет экспоненциально. Восемь таких молекул образуется на 4-м цикле, 32 738 – на 15-м и миллиард на 30-м. В ходе своих первых опытов Мулис и его коллеги не могли делать так много циклов. Основная проблема состояла в инактивации фермента при нагревании, так что порции свежего фермента приходилось добавлять вновь и вновь в каждом цикле.
Важнейшее усовершенствование, сделавшее ПЦР столь потрясающим методом, состояло в замене ДНК-полимеразы I так называемой Taq-полимеразой. Выделенная и термофильных бактерий, живущих в горячих источниках, Taq-полимераза легко выдерживает нагревание до 94 °C. При такой температуре цепи ДНК расходятся. Taq-полимераза лучше работает в горячих условиях, так что с ее помощью реакцию удлинения праймера ведут при 72 °C.
Использование Taq-полимеразы позволяет проводить ПЦР в полностью автоматизированном режиме, используя простой робот, называемый термоциклером или ПЦР-машиной. В обычной пробирке смешивают ДНК-мишень, четыре дНТФ и Taq-полимеразу в соответствующем буфере, содержащем необходимые ионы металлов. Затем пробирку помещают в термоциклер, который программируется на изменение температуры по следующей схеме: нагрев до 94 °C и выдерживание при этой температуре 1 минуту; охлаждение до 60 °C и выдерживание при этой температуре 1 минуту (на этом этапе праймеры связываются с комплементарными участками на концах мишени); нагрев до 72 °C и выдерживание при этой температуре 1 минуту для проведения реакции удлинения праймера при оптимальной температуре для Taq-полимеразы. Затем термоциклер начинает новый цикл по той же схеме (подъем температуры до 94 °C и т. д.). Затем еще цикл и еще цикл, сколько пожелает оператор.
Одна из многих замечательных особенностей ПЦР состоит в том, что вам не нужно очищать мишень от примеси чужеродной ДНК. Праймеры строго отберут только истинную мишень для размножения, даже если она представлена всего в одном-единственном экземпляре на фоне громадного избытка других молекул ДНК. Отметим также, что в отличие от живой природы, где размножение линейных молекул ДНК сопряжено с серьезным проблемами (см. главу 7), в случае ПЦР проблемы концов не возникает из-за того, что используются синтетические ДНКовые праймеры, а не РНКовые праймеры, как при репликации ДНК в клетке. Выбирая число циклов ПЦР, вы можете получить столько копий молекулы-мишени, сколько пожелаете (точнее, пока не исчерпаете дНТФ или праймеры).
За изобретение ПЦР Кари Мулис в 1993 году получил Нобелевскую премию по химии. Изобретение ПЦР повсеместно признано одним из самых главных прорывов в истории ДНКовых технологий, которая (эта история), как мы знаем, богата замечательными открытиями.
Существует две главные причины столь ошеломительного успеха этой, в сущности, крайне простой, если не сказать тривиальной, идеи. Во-первых, и это главная причина успеха, ПЦР работает потрясающе здорово, гораздо лучше, чем Мулис мог мечтать, когда идея впервые пришла ему в голову. Во-вторых, такой замечательный метод размножения ДНК оказался абсолютно незаменимым в бесчисленных биотехнологических приложениях. Если смысл жизни и впрямь состоит в ДНКовой цепной реакции, искусственная жизнь в данную минуту бурно процветает во многих тысячах ПЦР-машин в лабораториях всего мира.
Генно-инженерная фармакология
Первыми генной инженерией всерьез заинтересовались фармацевтические фирмы. Для них возможность сравнительно дешево производить практически любые белки в больших количествах открыла совершенно новые горизонты. Ведь помимо того, что белки – основные «рабочие молекулы» в клетке, они играют еще ключевую роль в регуляции процессов, идущих в организме в целом. Почти все гормоны – это небольшие белковые молекулы, содержащие от десятка до нескольких десятков аминокислотных остатков.
Раньше производство гормонов часто было весьма щекотливым делом. Хорошо еще, если, как в случае с инсулином, животный белок (из крупного рогатого скота или свиньи) может служить заменой человеческого гормона. Но во многих случаях это невозможно. Понятно, как фармацевтические фирмы ухватились за новые альтернативы. По их заказу генные инженеры в короткий срок получили штаммы бактерий, вырабатывающие различные человеческие гормоны.
Один пример – гормон роста. У некоторых детей из-за генетического дефекта не вырабатывается гормон роста, и без лечения они превращаются в карликов. Им необходимо вводить этот гормон, а взять его можно было в те времена, когда еще не было генной инженерии, только из человеческих трупов. Генная инженерия открыла путь к широкому производству этого гормона.
Другой пример – инсулин. Он необходим больным сахарным диабетом – недугом, распространенным весьма широко. Хотя большинство больных успешно обходятся животным инсулином, некоторым необходим человеческий, так как животный белок вызывает у них аллергию.
Но наибольший интерес вызвала возможность получения человеческого интерферона. Хотя о нем говорили давно, во многом он оставался загадкой. Твердо было установлено лишь то, что интерферон – белок, обладающий очень эффективным антивирусным действием, причем действие это универсально, интерферон эффективен против самых разных вирусов. Иными словами, интерферон для вирусов – это то же самое, что антибиотики для бактерий. Но с одним важнейшим отличием.
Антибиотик эффективно подавляет бактериальное заражение в любом организме, лишь бы бактерия не несла гены устойчивости к нему. Интерферон обладает видовой специфичностью – в организме человека подавлять вирусную инфекцию может только человеческий интерферон, в крайнем случае – обезьяний. И хотя борьба с вирусами (против которых антибиотики бессильны, и, вообще, кроме вакцин, до недавнего времени не было эффективных средств борьбы) – это проблема номер один, наладить получение достаточно дешевого и чистого интерферона не удавалось. О том, насколько плохо обстояло дело, можно судить по тому, что не получалось даже определить его аминокислотную последовательность. Генная инженерия в короткий срок, буквально за год, радикально изменила ситуацию.
В случае с интерфероном были реализованы два способа заставить клетку вырабатывать чужеродный белок, о которых шла речь в главе 4. Из клеток крови человека, в которых производство интерферона было стимулировано вирусной инфекцией, выделили интерфероновую мРНК, на ней синтезировали с помощью ревертазы ген интерферона, внедрили его в плазмиду и так получили первый бактериальный штамм, вырабатывавший искусственный интерферон. Удалось добиться очень высокой производительности. Была определена полная аминокислотная последовательность интерферона.
Тогда наступила очередь второго способа – чисто химического. По аминокислотной последовательности была построена нуклеотидная последовательность гена интерферона, и этот ген был синтезирован. Его опять же встроили в плазмиду и получили еще один штамм, вырабатывающий интерферон.
Искусственный интерферон оказался весьма эффективным противовирусным препаратом. Были сделаны такие опыты. Взяли шесть обезьян и разделили их на две равные группы. Всем обезьянам ввели вирус энцефаломиокардита, и так как у них не было иммунитета к этому вирусу, то всем им суждено было погибнуть. Действительно, три обезьяны, входившие в первую, контрольную группу, погибли через несколько дней после заражения. Второй группе обезьян за четыре часа до заражения, а также несколько раз после него вводили внутривенно искусственный интерферон. Все три обезьяны остались живы.
Получение искусственного интерферона позволило приступить к широким биологическим и клиническим испытаниям препарата. В результате интерферон уже используется для лечения ряда вирусных заболеваний, таких как гепатит и венерические болезни, вызываемые вирусом папилломы. Без генной инженерии интерферон остался бы до сих пор, да и надолго, многообещающим, но загадочным белком.