Знатность, заслуги отца и обширные родственные связи позволили и самому Федору Ивановичу быстро сделать придворную карьеру. В 1576 году, в 20 с небольшим лет, как и отец, он получил боярский чин, минуя все предыдущие ступеньки иерархической лестницы. В 1577 году молодой боярин принял участие в очередном Ливонском походе. Ему было доверено руководство одним из наиболее важных полков — полком Правой руки. Поход оказался очень удачным. Было взято множество ливонских городков и богатая добыча. Казалось, что Ливония уже на грани окончательного подчинения России. В 1579 году Ф. И. Мстиславский стал главнокомандующим — ему был доверен Большой полк. Для Русского государства это был очень тяжелый год — на его территорию вторгся польский король Стефан Баторий, который вознамерился свести на нет все ливонские завоевания царя Ивана IV. Цель короля состояла в том, чтобы захватить некоторые русские города на северо-западе и таким образом отрезать Ливонию от России. Федор Иванович получил важное задание — организовать оборону Новгорода Великого. С этой задачей он успешно справился. Король Стефан даже не пытался подойти к этому городу, застряв у Пскова.
После воцарения в 1584 году Федора Ивановича оба князя Мстиславских, отец и сын, поначалу сохранили свое высокое положение первых бояр в Думе. Однако начатые царскими родственниками Годуновыми преобразования в правительстве не понравились Ивану Федоровичу. Особенно возмутила его опала казначея П. Головина и его родственников. Князь полагал, что тот невиновен в растрате казны, поскольку она была истощена бесконечной Ливонской войной. Но противиться всесильным Годуновым было нельзя. В итоге И. Ф. Мстиславский сам попал в опалу. Ему было предложено добровольно отправиться в Кирилло-Белозерский монастырь и там постричься. В 1586 году престарелый князь умер.
Ссылка отца не повлияла на карьеру Ф. И. Мстиславского. Напротив, с 1585 года он сам становится во главе Боярской думы и во всех официальных церемониях занимает среди остальной знати первое место. Даже Годуновы не пытаются оттеснить его от трона, зная, что царь Федор благоволит к своему дальнему родственнику. Он даже доверил Мстиславскому одну из важных должностей во время своего венчания на царство — обсыпать себя золотыми монетами при выходе из кремлевских соборов. В тексте Чина венчания по поводу исполнителя этих обязанностей было сказано, что он должен быть царским родственником (например, Ивана Грозного обсыпал монетами младший брат Юрий). Ф. И. Мстиславский сохранил и свое звание главнокомандующего. Росписи полков, составляемые для планируемых походов и для пограничной Береговой службы на Оке, показывают, что он всегда во главе Большого полка.
В 1589 году пришла весть, что крымский хан собирается напасть на Москву. К тому времени у москвичей еще не стерлись из памяти воспоминания о пожаре и разгроме, устроенных в 1571 году Девлет-Гиреем, поэтому новая угроза всех взбудоражила. Организовать заслон крымцам на Оке было поручено князю Федору Ивановичу. Все лето простоял он на берегу, но крымцы, к счастью, не появились. На этом служба Мстиславского не закончилась. Уже в декабре того же 1589 года царь Федор предпринял грандиозный поход на Запад, чтобы вернуть утраченное отцом побережье Финского залива и территории в Карелии. Снова князь Федор Иванович встал во главе Большого полка, с котором был сам царь. Пока другие полки брали Ям, Орешек, Копорье, Большой полк направился прямо к Иван-городу и Нарве — Ругодиву. Оба города-крепости находились на разных берегах реки Наровы.
Вскоре мощный артиллерийский обстрел заставил жителей Иван-города сдаться, но Нарва уцелела, поскольку царь Федор решил, что форсирование реки под артиллерийским обстрелом неприятеля вызовет большие жертвы. Поскольку крепость была сильно разрушена, шведы, не знавшие о планах царя, сами предложили начать переговоры о перемирии. Их поручили вести Мстиславскому. Он оказался неплохим дипломатом: не вступал в перепалку, в бесконечные дискуссии и твердо вел свою линию. В итоге Россия получила назад без всякого выкупа утраченные ранее города: Иван-город, Ям, Орешек, Копорье. Позднее после удачного Выборгского похода была возвращена Корела, и Швеции пришлось подписать в 1595 году Тявзинский мирный договор, выгодный для Русского государства.
В апреле 1591 года вновь пришли тревожные вести с южной границы — крымский хан Казы-Гирей собирал войско для похода на Русь. Остановить его предстояло только небольшим по численности полкам Береговой службы под командованием Ф. И. Мстиславского. (Основное войско стояло у Новгорода, поскольку в то время мирный договор со Швецией еще не был подписан.) Когда были составлены росписи полков, то выяснилось, что многие молодые воеводы недовольны своими назначениями и начали местнические тяжбы. Более того, оказалось, что черкесский князь Б. К. Черкасский имеет претензии к самому главнокомандующему Мстиславскому. Оборона государственных приграничных рубежей оказалась на грани срыва. Пришлось Федору Ивановичу при поддержке царя Федора наводить в полках порядок, проявлять спокойствие и твердость духа. Не вступая в местнические споры, он направился на линию обороны, показывая пример верности долгу. Остальные воеводы последовали его примеру.
В начале июня пришла весть, что из Крыма выступило огромное войско хана. По подсчетам дозорщиков, оно состояло из 100 000 всадников, которые двигались на большой скорости прямо по направлению к столице. Вероятно, хан узнал, что у Москвы мало защитников, и решил воспользоваться ситуацией.
Действительно, в распоряжении Ф. И. Мстиславского было не больше нескольких тысяч воинов. Если бы они попытались остановить крымцев, то были бы попросту смяты и раздавлены. Поэтому князь срочно отправил гонца в Москву с сообщением о большой опасности. Сам же выслал разведчиков к ханскому войску, которые должны были следить за его передвижением. Вскоре выяснилось, что во главе войска стоит сам Казы-Гирей, с ним едут четыре царевича. Обходя заставы, они направляются прямо к Москве.
Царь Федор очень обеспокоился тревожными известиями с берегов Оки. Он понял, что Мстиславскому не задержать врага, и приказал ему со всеми полками срочно отступать к столице. Ведь они были единственными защитниками города, и лишиться их было смертельно опасным. 30 июня войско князя Федора Ивановича было уже на реке Пахре в 30 верстах от города. На Окской переправе оставили только 300 разведчиков «о дву конь» под началом С. Б. Колтовского. Мстиславскому и остальным воеводам было приказано немедленно ехать к царю в Кремль на военный совет. Положение с обороной города действительно было очень сложным. Количество защитников было раз в 10 меньше, чем нападавших. Сражаться с крымцами в открытом бою было просто невозможно. Поэтому в районе Данилова монастыря организовали «гуляй-город» — походную крепостицу на колесах. Она состояла из возов с пушками, прикрытыми дубовыми досками. Это сооружение было удобно тем, что в телеги можно было впрячь лошадей и быстро перевезти на другое место или перестроить в нужном направлении. Первоначально решили, что конница встретит противника у Коломенского и попытается с ним сразиться во время переправы. Но потом царь Федор пришел к мысли, что на открытой местности воины будут беззащитными и падут под обстрел очень метких татарских лучников. Поэтому всем полкам было велено встать под защиту «гуляй-города» и в открытый бой с главным крымским войском не вступать.
2 июля пришло печальное известие о том, что отряд Колтовского разбит, сам он ранен и едва спасся. Хан со всеми ордами переправился через Оку и как туча движется к столице. Ранним утром 4 июля русские воины встали на линию обороны у Данилова монастыря. Каждый знал свое место и четко выполнял указание главнокомандующего Мстиславского. Все понимали, что победу в сложившейся трудной ситуации могут принести только стойкость, мужество и слаженность. Паника или трусость могли стать роковыми и для защитников, и для столицы.
Царь Федор знал, что многое зависит и от его собственного поведения. В 1571 году столица пала во многом из-за того, что его отец Иван Грозный трусливо бежал. Поэтому он лично приехал в войско и спросил воевод и простых воинов о здоровье, осмотрел оборонительные укрепления. Этим он поднял у всех боевой дух и внушил веру в общую победу. В помощь полкам Мстиславского были присланы все члены правительства и служители царского двора. Командовать ими было поручено царскому шурину Борису Годунову. Он и стал заместителем главнокомандующего. Хотя Борис считал себя чуть ли не царским наследником, поскольку у царя Федора все еще не было детей (царевна Феодосия родилась только в 1592 году), но указания князя Мстиславского выполнял без всяких возражений. Сам он в сражениях участвовал редко и военного опыта не имел.
В этот же день в окрестностях Москвы появились отряды крымских царевичей, которые попытались вызвать на бой защитников. Поскольку они были малочисленными, то Мстиславский выставил против них конных иностранных наемников — шведов и литовцев. Хорошо вооруженные, с четким строем, они быстро разогнали крымцев. Разведчики донесли, что основное ханское войско расположилось в овраге у речки Котлы. Там оно чувствовало себя в относительной безопасности, поскольку на крепостных башнях города стояли дальнобойные орудия. Казы-Гирей направился на Воробьевы горы, чтобы осмотреть местность. Мощные крепостные стены и естественные речные преграды показали ему, что взять Москву будет очень трудно, тем более что у татар не было стенобитных орудий и опыта брать каменные крепости.
Мстиславский знал, что главным «козырем» защитников являются артиллерийские орудия, которые не только могут сразить противника, но и внести в его ряды панику — татарские лошади боялись взрывов. Поэтому, как только немного стемнело, он начал обстреливать позиции хана. Кроме того, стали палить и из орудий, установленных на крепостных стенах. Сделано это было на тот случай, если крымцы попробуют начать атаку под прикрытием темноты.