Проблема в том, что в лаборатории Мартина не было подходящего оборудования для того, чтобы поместить GFP в такие маленькие клетки (хотя зигота достигает 90 микрон в поперечнике, размер клеток бластоцисты равен примерно 10 микронам). Мы хотели изменить электрические свойства клеточной мембраны, чтобы ввести GFP внутрь клетки, не повреждая ее иглой. Для изучения развития бластоцисты я обратилась к Ричарду Гарднеру из Оксфорда, у которого были схожие идеи наряду с нужными навыками и оборудованием.
Я ездила на автобусе туда-сюда между университетскими городами (по три часа в каждом направлении), таская с собой большой белый ящик с сухим льдом, охлаждающим мРНК моего модифицированного GFP (мРНК очень нестабильна и должна храниться в холоде). Когда я приезжала в лабораторию Ричарда, он вводил MmGFP в качестве маркера в клетки, которые выбирал точно на обоих концах оси симметрии бластоцисты, определяя анимальный полюс по второму полярному тельцу — прочной связи между яйцеклеткой и бластоцистой, которую сам же и обнаружил [16].
Промаркировав бластоцисты, Ричард переносил их в приемных матерей, позволяя там развиваться, а через несколько дней извлекал. Эти эмбрионы я забирала в Кембридж и проверяла под конфокальным микроскопом расположение MmGFP-меченых клеток относительно передне-задней оси эмбриона прямо на входе в стадию гаструляции.
Результат деликатного труда по созданию многих десятков эмбрионов нас разочаровал. Мой MmGFP-маркер не работал. По мере деления клеток он «разбавлялся» из-за высокой скорости роста эмбриона между стадиями бластулы и гаструлы. К моменту гаструляции ни одна клетка уже не светилась зеленым. Ричард потерял надежду, да и я тоже. Но не окончательно.
Я вернулась к этой проблеме, когда случайно познакомилась с Роджером Педерсеном на конференции в Юте, где представляла свои первые результаты отслеживания клеток. Роджеру понравилась моя мечта подсмотреть за клетками на протяжении всей стадии имплантации, потому что он сам когда-то исследовал клеточные линии в Калифорнийском университете в Сан-Франциско. Ему настолько понравилась идея, что он одолжил мне недостающую часть оборудования из своей лаборатории и, что примечательно, пожелал взять творческий отпуск и поработать вместе со мной в моей недавно сформированной группе в Кембридже.
После многих неудачных недель мы наконец-то добились успеха. Секрет состоял в том, чтобы вводить маркер в строго определенном количестве — не слишком мало, чтобы он не «разбавился» на заключительном этапе эксперимента (гаструляции), и не слишком много, чтобы он не перегрузил клетку и не привел к ее гибели. Так, благодаря принципу Златовласки[6] мы смогли проследить, где оказались помеченные нами клетки.
Интерпретировать результаты было нелегко, поскольку у меченых клеток было множество потомков, которые не всегда выполняли те же функции. Нас так и подмывало сделать вывод о том, что клетки растут случайным образом, и прекратить дальнейшие поиски доказательств. Но мы решили продолжить. В тот момент Роджер внес еще один значимый вклад в наш проект. Он убедил Роберту Вебер, занимавшую штатную должность в Калифорнийском университете в Сан-Франциско, поработать техником в моей лаборатории.
Но даже с помощью Роберты и подходящего оборудования понадобился год, чтобы произвести достаточное количество меченых эмбрионов для распознавания связи между полярностью бластоцисты и полярностью эмбриона после имплантации. Эта связь не была детерминированной и поэтому всегда похожей, но все-таки мы добыли много информации. Мы с Роджером написали статью и опубликовали ее в 1999 году все в том же Development [17]. В дальнейшем эти результаты подтвердили мою гипотезу о том, что причины нарушения симметрии возникают в процессе развития раньше, чем предполагалось.
Эмбриологическое искусство
У меня по-прежнему польский акцент, и мне нравится думать о том, что я его сохраняю ради Джона Гёрдона, который просил меня никогда его не терять. Из-за дислексии я долго осваивала английский язык, чтобы знать его в совершенстве. Может, поэтому я до сих пор люблю открывать мир искусства, от живописи и фотографии до дизайна, театра и кино. Художественное мышление по-разному отразилось на моих исследованиях, от раскрашивания клеток, позволяющего разобраться в сложных клеточных узорах эмбриона, до создания из стволовых клеток эмбрионоподобных структур.
Этот вид искусства подарил мне не только завораживающие рисунки, но и новые идеи, а также раскрыл детали онтогенеза, превратив молекулярные процессы в яркие цвета, видимые невооруженным глазом.
Оттачиваемое моей командой искусство маркировки и перемещения клеток изменило мое представление о танце жизни. Увидев, что клетки в четырехклеточном эмбрионе и, вероятно, в двухклеточном не идентичны друг другу (как утверждают учебники), я поняла, что придется приложить много усилий, чтобы убедить себя в реальности увиденного, и еще больше усилий, чтобы убедить в этом своих коллег. Мне надо было довести до совершенства свою работу и свое эмбриологическое искусство.
Глава 4Нарушение симметрии
История любой новой жизни — это история роста, развития и преобразования. Оплодотворенная яйцеклетка имеет необыкновенную способность делиться на множество клеток, самостоятельно выстраивающихся в уникально организованную материю — эмбрион, который со временем создаст организм человека. Каким образом некоторые клетки эмбриона становятся настолько непохожими на соседние, что создают организм, пока другие формируют плаценту? Все дело в нарушении симметрии.
Как только симметрия развивающегося эмбриона нарушается, клетки делают выбор, развиваясь в разных направлениях. Но почему? Из какой клетки раннего эмбриона появится плацента? Какая клетка проложит путь ребенку? У человеческого эмбриона есть и питающий его желток — так какая же клетка превратится в желточный мешок, внутри которого будет расти эмбрион?
Ко времени имплантации эмбриона все эти решения должны быть приняты. И каждое сопровождается событием, нарушающим симметрию.
Дальше предстоит еще больше таких событий. Например, из какой клетки эмбриона вырастет голова, а из какой сердце? Где будет верх, а где низ? Как отличить правую часть от левой? Заднюю от передней? Нарушение симметрии эмбриона является одним из важнейших процессов ранней жизни и основополагающих процессов для создания плана тела. Большая часть моих исследований в той или иной степени посвящена попыткам понять, когда и как по мере развития новой жизни эмбрион нарушает свою симметрию. Мне это кажется волшебством.
В этом великом деле партнерство и сотрудничество были моими помощниками. На пороге нового тысячелетия к нашей команде в качестве постдока[7] присоединилась Каролина Пиотровска из Польши. Каролина была необыкновенно одаренной в отношении манипуляций с эмбрионами, эдакий эмбриологический вариант тех, кого в Великобритании называют green fingers, или зеленые пальцы (возможно, они и вправду флуоресцировали зеленым свечением GFP). Для выполнения серии сложных экспериментов нужны легкая рука и ловкость. У Каролины были все эти навыки, а еще правильный ментальный настрой, ведь такая утомительная работа легко могла привести к ошибке.
Большинство аспирантов оказываются шокированы переходом от той мизерной информации, что преподается на курсе, к настоящей научной работе в лаборатории, где важна ловкость рук и где приходится осваивать новые навыки. Для многих является сюрпризом тот факт, что большая часть новаторских экспериментов, проводимых для подтверждения новых фактов и проверки новых идей, никогда не проходит гладко, по крайней мере, не сразу — понадобится терпение, чтобы создать правильные условия. Провал для исследовательских работ в порядке вещей. Мы учимся на ошибках и идем дальше. У Каролины было идеальное сочетание терпения, выдержки, целеустремленности и неиссякаемого оптимизма, позволявшее ей не сдаваться, если эксперимент не показывал ничего путного, и работать до тех пор, пока она не убеждалась, что все сделано правильно и что все контрольные эксперименты указывают на то, что результаты не являются артефактом (следствием эксперимента как такового) и потому заслуживают доверия.
Идеи, возникшие в результате нашей совместной работы, привели к моей первой публикации в Nature. Поскольку это престижный журнал, коллеги по-настоящему обратили на мою группу внимание. Наша работа произвела фурор. Но не в том смысле, в котором я ожидала.
Симметрия стала центром отвратительных дискуссий. Оглядываясь на прошлое с научной точки зрения, могу сказать, что это был самый тяжелый этап моей научной жизни, казавшийся бесконечным. Джон Гёрдон помог мне своей спасительной дружбой и поддержкой. В свое время он предупреждал, что, если мы обнаружим нечто действительно важное, но противоречащее существующей догме, пройдет десять лет, прежде чем наше открытие будет подтверждено и принято другими группами, и еще десять, прежде чем оно получит признание. Я оказалась просто еще одним человеком, пострадавшим в долгой борьбе за понимание премудростей симметрии. Это событие на годы стало моим тяжким бременем.
Оплодотворение
По прибытии Каролины в Кембридж мы начали с изучения зарождения — Большого взрыва[8] индивидуального развития, момента встречи сперматозоида и яйцеклетки. Последняя — не заурядная клетка, а та, что преисполнена потенциалом и уникально экипирована для создания новой жизни. Это клетка, которая может расти и делиться, чтобы создавать историю, записывать ее и даже менять.
Когда на одном конце развивающейся клетки раннего эмбриона накапливается конкретный набор белков (PAR-белков, о которых я уже упоминала), делающий его непохожим на другой конец, клетка приобре