B недавнее время из лаборатории Гофмейстера появилась работа Глэснера, в которой он дает новый способ разделения ферментов в желудочном соке. Но и этот способ по проверке оказался ошибочным. Методика Глэснера заключалась в прибавлении к раствору профермента двух солей: фосфорнокислого натра и уксуснокислого уранила. При этом в растворе происходит между солями реакция взаимного обмена и образуется осадок фосфорнокислого уранила, который, по мнению Глэснера, увлекает с собой один фермент, другой же фермент остается в растворе. И действительно, если испытывать раствор на переваривающую функцию, то мы ее не получим, но тем не менее никакого разделения тут не существует. Автор не обратил внимания на то, что при его способе в растворе должен образоваться уксуснокислый натрий, который значительной степени задерживает, как бы уничтожает растворяющее действие фермента. Что же касается молоко свертывающего действия, то при оценке его автор пользовался крайне грубым способом определения. Он брал литр молока, и если это молоко не свертывалась от сока в течение получаса, то он отрицал в соке свертывающее действие.
Как проверить эти заключения? Мы проделали опыты Глэснера. При этом мы прибавляли к соку фосфорнокислого натрия и уксуснокислого уранила в одном случае столько, чтобы получился лишь очень небольшой осадок, который не может увлечь фермента, а в другом случае - больше, так чтобы получился очень большой осадок, при образовании которого можно рассчитывать на увлечение им фермента. Испытывая затем соки на переваривание и свертывание, мы увидели полный параллелизм ослабления и переваривающей и свертывающей функции. Таким образом и здесь открывается как ошибочность методики, так и источник ошибки.
Следующий способ, которым думали разделить ферменты, принадлежит Гамарстену. Заключается он в том, что нейтрализованный желудочный сок взбалтывается с порошком углекислой магнезии. По Гамарстену, пепсин увлекается порошком магнезиальной соли, а химозин остается в растворе. И действительно, фильтрат сока, обработанного углекислой магнезией, молоко свертывает, но переваривающего действия не обнаруживает; следовательно, параллелизм как будто нарушен. На самом деле и этого нет. Стоит только разбавить фильтрат и соответственно подкислить, параллелизм восстанавливается. Таким образом мы имеем здесь дело не с исчезновением из фильтрата пепсина, а с замаскированием растворяющего действия сока вследствие неблагоприятных условий для его проявления.
Таким образом параллелизм растворяющего и свертывающего действий желудочного сока при такой методике восстановлен; этого мало: надо было показать и пропорциональность обоих действий. Эта задача долгое время не поддавалась разрешению; в то время как свертывающее действие фильтрата на молоко уменьшалось, по сравнению с контрольным - нейтральным соком, сравнительно немного (в 15-30 раз), растворяющее действие фильтрата падало в огромное количество раз (в 500 2000 3000 раз). Такой результат давал повод, пожалуй, сделать заключение о самостоятельности каждой функции, о существовании двух ферментов, и, надо сознаться, нам пришлось много побиться, чтобы уничтожить такую непропорциональность обеих функций и сблизить их. Решение этой задачи далось нам в руки, наконец, почти случайно.
Дело в том, что, обрабатывая сок углекислой магнезией, мы подщелачиваем его. Свертывающее действие фильтрата и идет в этой реакции. Для определения растворяющего действия мы должны были подкислить фильтрат, мы подкисляли и получали то во много раз слабейшее действие, о котором я сейчас упоминал. После долгих попыток усилить это действие мы убедились, что для этого надо подкислять не сразу, в два приема: сначала довести щелочной фильтрат до нейтральной реакции, оставить его в таком виде на некоторое время и затем уже подкислить. В этом случае переваривающее действие фильтрата значительно вырастает. Этот в высшей степени интересный факт иллюстрируется следующей таблицей (5).
Из табл. 5 видно, что во втором случае, где фильтрат был сперва нейтрализован и затем подкислен, растворяющая сила его ослабела гораздо меньше, чем свертывающая функция. Между тем при подкислении фильтрата сразу бывает наоборот.
Раз проведение фильтрата через нейтральную стадию до подкисления его значительно увеличивает растворяющее действие, естественно было посмотреть, как влияет продолжительность нейтрального состояния на переваривающую силу. С этой целью поставлен опыт (табл. 6): щелочной фильтрат нейтрализован и из него через разные промежутки времени брались порции и тотчас подкислялись.
Отсюда (табл. 6) ясно, что чем дольше стоял фильтрат в нейтральном виде, тем больше вырастала его переваривающая сила.
Покончив с этим пунктом, мы должны перейти к следующему возражению. Нам говорят: какое может быть тождество между пепсином и химозином, когда растворение белка и свертывание молока идут по двум разным правилам? Какое может быть тождество, когда по растворяющему действию сока количество фермента прямо пропорционально квадрату миллиметров переваренной белковой палочки, а по свертывающему действию мерой служит обратная пропорциональность временам свертывания? Но против такого возражения можно выставить теоретическое рассуждение. Тождества правил можно требовать для одинаковых реакций. В данном же случае одинаковые правила вовсе не обязательны, так как самые реакции-то разные. Для хода реакции имеет громадное значение химическая среда. Мы видим уже, что известные химические манипуляции с соком реакцию растворения сводят к нулю, оставляя в силе реакцию свертывания. Далее, изменяя условия среды, нетрудно заставить каждую из этих двух реакций пойти по разным правилам. Возьмем реакцию свертывания. Вот ее обычный тип (табл. 7).
Здесь (табл. 7) реакция свертывания идет по правилу обратной пропорциональности временам свертывания: где сычуга взято втрое больше, там и время свертывания молока втрое короче. Но это правило легко нарушить, что видео из следующей таблицы (8).
Взяв кислый сок, мы получим уже новое правило (табл. 8). Если 0.1 куб. см сока свернул молоко в 11 минут, то по предыдущему правилу 0.2 этого сока, содержащее вдвое больше фермента, должно бы свернуть вдвое скорее, т. е. в 5.5 минуты. А на самом деле свернуло гораздо скорей - в 3 минуты. Получилось новое правило - обратное отношение квадратным корням из времеи свертывания. Чем же объясняется это? Тем, что, приливая к молоку вдвое больше сока, приливал не только вдвое большее количество фермента, но и вдвое больше кислоты, которая и ускоряет ход реакции. Но я могу и замедлить реакцию.
Здесь (табл. 9) я получаю отношение, обратное квадратам времени свертывания. Здесь берутся большие количества сока, и сока нейтрального. Чем больше я его прибавлю к молоку, тем больше я и разжижаю молоко, затрудняя его свертывание. Таким образом и создается третье правило для свертывающего действия.
То же самое можно показать и для другой реакции -- реакции растворения (табл. 10).
Из этой таблицы (10) видна прямая пропорциональность между количеством фермента и квадратами миллиметров переваренной белковой палочки - правило Шюца-Борисова.
Теперь разбавим желудочный сок кислотой, а водой (табл. 11).
Из этих цифр (табл. 11) с очевидностью видно, что получилось уже не отношение квадратов, простое. Почему? Потому что мы изменили условия реакции, что на первый взгляд может показаться и несущественным. В первом случае, разбавляя сок соляной кислотой, мы постепенно изменяли отношение кислоты к ферменту, а во втором случае это отношение оставалось неизменным: разбавляя сок, например, в 8 раз водой, мы в 8 раз уменьшали концентрацию фермента и во столько же раз уменьшали и концентрацию кислоты. И в результате получили новое правило.
Таким образом, изменяя реакцию среды, мы можем каждую функцию фермента направить по разным правилам.
После всех этих опытов, которыми мы не только выяснили ошибочность заключений сторонников двойственности ферментов, но и указали также источники этих ошибок, не должно оставаться никакого сомнения в том, что две эти функции пищеварительных соков представляют собою проявление одного и того же фермента.
Н. П. К р а в к о в: На основании этих исследований нельзя ли также сделать предположение о единстве трех ферментов панкреатического сока?
И. П. П а в л о в: Нет, ибо в панкреатическом соке нет того параллелизма, на который указывал здесь. и крахмальный ферменты разрушаются быстро, а белковый остается.
Принадлежность протеолитического и молоко свертывающего действий различных пищеварительных соков одним и тем же белковым ферментам (совместно с С. В. Паращуком)[57]
Наша работа имела задачей исследовать при различных условиях взаимные отношения белок растворяющего и молоко свертывающего действий различных пищеварительных соков.
Вся посуда, служившая для опытов как с перевариванием белка, так и со свертыванием молока, всегда предварительно кипятилось. Молоко для коротких опытов (в течение нескольких минут) бралось сырое, без каких-либо прибавлении; для длинных же - или стерилизованное, или с прибавлением в разных опытах хлороформа, каломеля, тимола и толуола. Для свертывания обыкновенно применялась порция 10 куб. см. Свертывание производилось в водяном термостате при 38° С. При определении переваривающей силы пользовались белковыми палочками по Месту (с яичным или сывороточным белком), а также, в некоторых случаях, и свежим фибрином. Соки отмеривались бюреткой с сотыми делениями куб. сантиметра.
I. Желудочный сок
Желудочный сок в большинстве опытов применялся для свертывания кислым. В каждом ряде сравниваемых порций сок приводился к одной и той же кислотности посредством 0.5% раствора соляной кислоты, причем происходящее при этом разведение уравнивалось дистиллированной водой. Впоследствии будет подробно объяснено, почему мы вообще считали себя вправе, а во многих случаях даже умышленно предпочитали употребление кислых растворов ферментов вместо нейтральных. Здесь достаточно сказать, что наше молоко (сырое, без всяких примесей) при добавлении одного куб. см 0.5% соляной кислоты (на 10 куб. см молока) никогда не свертывалось в термостате раньше десяти часов. С другой стороны, все наши порции сока после кипячения действовали как растворы 0.5% соляной кислоты, т. е. также не свертывали молоко ранее десяти часов. Ясно, что тождественность кислотности в сравниваемых порциях давала полную возможность обнаруживать различные свертывающие действия различных порций сока, т. е. определять: какая порция содержит в себе больше, какая - меньше фермента. Установить точное количественное отношение обоих исследуемых действий, конечно, представляет трудную задачу. Это явствует уже из того, что известные правила обоих действий имеют силу только для определенных концентраций ферментов, не совпадающих при обоих действиях, и вообще не могут претендовать на абсолютную точность. Вследствие этого работа наша почти исключительно занималась исследованием параллелизма, а не пропорциональности белок растворяющей и молоко свертывающей функции пищеварительных соков.
Только постепенно выяснялся нам тот способ, которым можно было бы установить точное количественное отношение обоих испытуемых действий. Поэтому лишь в конце нашего исследования мы могли более или менее с успехом применить этот способ на немногих случаях. Эти случаи и все, что мы знаем теперь о молоко свертывающем действии и о протеолитической реакции, не оставляют в нас ни малейшего сомнения, что вскорости мы достигнем пропорциональности действия всюду, где имели до сих пор только параллелизм.
Прежде всего подвергались исследованию оба действия соков при различных физиологических условиях работы пепсиновых желез. Соки получались из изолированных, по способу одного из нас, желудочков. Сравнивались соки, излившиеся на три различные сорта еды: молоко, мясо, хлеб (табл. 1).
Кислотность и разведение уравнены только в каждом горизонтальном ряду (табл. 1).
Из табл. 1 следует, что в различных сортах сока оба действия идут вполне параллельно. (Нельзя при этом не обратить внимания на курьезное обстоятельство, что химозина -- молочного фермента, - если стоять на общепринятой точке зрения, как раз всего меньше выделяется на субстрат его действия). Однако в той же таблице бросается в глаза резкая непропорциональность в действиях. При переходе от мясного сока к молочному молоко свертывающее действие падает гораздо значительнее, чем белок растворяющее. Оставляя объяснение этого обстоятельства до позднейших частей нашего изложения, мы приводим сейчас такую вариацию опыта, которая дает нам несомненную пропорциональность там, где имеется на первый взгляд только грубый параллелизм. Приводим таблицу этого опыта (табл. 2).
В первом столбце (табл. 2) обозначен сорт сока. Во втором столбце таблицы мы имеем переваривающую силу, в миллиметрах белковой палочки, по Мэтту, различных сортов, разбавленных в 10 раз раствором 0.2% соляной кислоты и стоявших в термостате одинаковое число часов (16 часов). В третьем столбце взяты квадраты чисел, изображающих переваривающую силу, т. e. относительные количества фермента. В четвертом столбце числа показывают, во сколько мясной и молочный соки слабее хлебного. В пятом приведены количества соков, эквивалентные по содержанию фермента. В шестом столбце приведены цифры прибавленной к порциям сока предшествующего ряда 0.2% соляной кислоты для того, чтобы во всех этих порциях кислоты было одинаковое количество. Количество прибавляемой кислоты рассчитывалось на основании титрования исходных разбавленных соков. В седьмом столбце имеются количества дистиллированной воды для того, чтобы во всех этих порциях уравнять массу жидкости. Таким образом мы имели три порции сока трех вышеозначенных сортов, в которых содержалось одинаковое количество фермента, переваривающего белки, одинаковое количество кислоты и одинаковое количество жидкости. Когда эти порции были прилиты, каждая к 10 куб. см молока, то получились цифры свертывания молока в секундах, приведенные в восьмом столбце таблицы. Из этого столбца ясно, что эквивалентные по содержанию белок растворяющего фермента количества хлебного, мясного и молочного соков, при прочих равных химических условиях, проявили совершенно одинаковое молоко свертывающее действие, т. е. оба наши действия в различных сортах сока содержатся строго пропорционально.
Затем испытывались часовые порции соков, излившихся на разные сорта еды. На прилагаемой таблице (3) все порции сока собраны от одной собаки и уравнены в отношении кислотности и разбавления. Для свертывания молока бралось по 0.3 куб. см сока (табл. 3). Отчетливый параллелизм выступает и здесь. Неболыние отклонения, встречающиеся то там, то сям, суть естественные следствия недостаточности методики, при небольших колебаниях в величине переваривания и при больших сроках времени свертывания. Такие небольшие отклонения то чаще, то реже встречались и в других подобных опытах. Случайность их происхождения, несомненно, доказывается тем, что они никогда не приурочивались ни к определенному сорту еды, ни к определенному часу отделительного периода.
Мы заключаем, что при различных физиологических условиях работы пепсиновых желез, как бы ни колебались абсолютные количества фермента в соке, оба действия его всегда идут параллельно.
Мы переходим к различным изменениям сока вне организма.
Кислый сок, полученный методом так называемого мнимого кормления собак, ставился в термостат, где он подвергался медленному разрушению. Из него каждый день или через день-два брались отдельные порции для исследования. Для контроля белковых палочек употреблялась особая порция того же или другого сока, оставшаяся стоять при комнатной температуре, как это делается в лаборатории постоянно для исключения каких-либо случайностей. Из нее также брался сок для свертывания молока. Гак как кислотность сока от стояния термостате или при комнатной температуре не изменяется сколько-нибудь заметно, то различные порции наших соков могли быть прямо сравниваемы как в отношении переваривающей силы, так и в отношении свертывающего действия. Свертывание посредством термостатного сока начиналось с небольших количеств сока. Когда время свертывания значительно удлинялось, переходили на большие количества. Когда белковые палочки перестали перевариваться термостатным соком за 10 часов, переходили к фибрину (табл. 4).
Совершенно параллельные отношения обоих действий сока, при долговременном стоянии его вне организма, бьют в глаза. В то время как в термостатном соке оба действия совершенно параллельно в течение 41-го дня постепенно приближаются к нулю, в соке, стоявшем при комнатной температуре, эти действия, в течение того же времени, остаются совершенно нетронутыми. Этот опыт совершенно с тем же результатом был проделан еще раз. Точно такой же опыт был произведен еще с новою порцией сока, с тою только разницей, что сок, употребляемый для свертывания молока, всякий раз нейтрализовался углекислым барием. Результат опыта был совершенно одинаков с предшествующим.
Наконец в следующем подобном ряде определений желудочный сок, применявшийся для свертывания молока, нейтрализовался содой. В этом случае свертывающее действие саморазрушающегося в термостате сока исчезало раньше, сравнительно с растворяющим. Причина этого явления будет объяснена впоследствии.
Кислый желудочный сок, полученный методом мнимого кормления, подвергался в течение пяти минут действию более высоких температур, а затем исследовался как на растворяющее, так и на свертывающее его действие (табл. 5). 5).
Параллельное отношение обоих действий отчетливо выступает и в этой таблице (5). До 52° падение обоих действий медленное, после 52° оно делается стремительным для обоих, а при 62 20 приближается к нулю.
Далее исследовалось влияние различных химических веществ на ферментное свойство сока. Есть много случаев, где преследуемый нами параллелизм при этом как будто резко нарушается. Если к желудочному соку прибавить разных солей, желчи, алкоголя, сахару и т. д., то переваривающая сила его резко падает, а свертывающее действие может остаться без малейшего изменения или даже усилиться. И лишь только последнее действие не упало, можно быть уверенным, что проявится и нормальная сила растворения, раз только сок будет разживин, т. е. будет понижено в нем процентное содержание вещества, тормозящего реакцию растворения (табл. 6).
В приведенной таблице (6), как видно, употреблено 4 различных нормальных сока и только в каждом ряде с одним и тем же соком разбавление производилось раствором кислоты одной и той же кислотности, а свертывание молока одним и тем же количеством сока, так что все ряды не могут быть сравниваемы между собою в отношении переваривающего и свертывающего действий.
Там же (исключая специальные случаи относительно свертывания и нами еще не исследованные), где падает свертывающее действие, обыкновенно падает и растворяющее, например при действии щелочи и щелочных солей. В таком случае, очевидно, идет дело о разрушении фермента или переводе его в недеятельное состояние. При этом также обращает на себя внимание параллелизм обоих действий. Как известно, ферменты желудочного сока очень чувствительны к щелочам. Даже нейтрализация, и самая осторожная, NaHCO3 и Na2СОз, хотя бы до совершенно одинаковой степени нейтральности, уже дает разницу в ферментном действии сока; причем при нейтрализации Na2CO3 обыкновенно получается меньшее ферментное действие. И это небольшое уменьшение одинаково обнаруживается как на растворяющем, так и на свертывающем действиях (табл. 7).
II. Поджелудочный сок
Тот же параллелизм, который мы наблюдали на желудочном соке, мы встретили и на поджелудочном. Обыкновенно в этих опытах к молоку на 10 куб. см мы прибавляли куб. см или 1 куб. см 0.5% соляной кислоты и в такое молоко вливали одну или несколько десятых куб. см испытуемых пороий поджелудочного сока. Делали это мы для того, во-первых, чтобы несколько задержать реакцию растворения казеина трипсином. Без этого свертывающее действие, особенно в случае сильного панкреатического сока, так летуче, что часто составляет большой труд его гочно уловить. Предварительно значительно подкисляя молоко, мы приближали, до известной степени, отношения обеих испытуемых реакций при панкреатическом соке к тому, что имело место при желудочном соке, т. e. благоприятствовали свертывающей реакции и затрудняли растворяющую. Во-вторых, беря больше кислоты и меньше сока, мы ослабляли значение колеблющейся щелочности панкреатического сока.
Прежде всего оказалось, что зимогенный по растворяющему действию сок не действителен и по отношению к свертыванию молока. Чтобы сок проявил оба свои действия, к нему нужно прибавить один и тот же кишечный сок. Проявление обоих действий под влиянием кишечного сока, судя по некоторым нашим опытам, происходит с одной и той же быстротой.
Мы имели панкреатический сок очень различного происхождения: от собак с постоянными фистулами при различных физиологических условиях его возбуждения (различные сорта пищи, различные часы отделительного периода и т. д.) и от собак с острых опытов, получаемый посредством раздражения блуждающих и симпатических нервов, вливанием кислоты и мыла в кишки и впрыскиванием секретина в крови. Активировав вполне эти соки, мы пробовали их как на растворяющее, так и на свертывающее действие. И здесь, как при желудочном соке, несмотря на все указанное разнообразие физиологических условий выработки сока, мы никогда не видали расхождения обоих наших действий, исключая небольшие, непостоянные отклонения, очевидно, случайного происхождения. Представляю таблицу (8), где порции сока различного происхождения расположены по убывающему растворяющему действию, выраженному в миллиметрах растворенной белковой палочки. молоку на 10 куб. см прибавлялось по 1 куб. см раствора соляной кислоты 0.5% и по 0.2 - панкреатического сока. Все порции сока одинаково активированы.
Затем исследовался также параллелизм обоих действий при разрушении сока. Было известно давно, что панкреатический сок при стоянии в термостате быстро разрушается. Прибавление киназы чрезвычайно ускоряет это разрушение. Мы поэтому исследовали активированный киназой панкреатический сок при его стоянии в термостате в отношении обоих его действий. Приводим один из таких опытов.
Панкреатический сок с 10 % кишечного сока поставлен в термостат (t° to 38) в 12 часов 17 минут. В молоко для свертывания на каждые 10 куб. см прилито 0.5 куб. см соляной кислоты 0.5%, а затем в указанные в табл. 9 времена по 0.3 куб. см смеси соков.
Такая же смесь из тех же соков для переваривания белка приготовлена и поставлена в термостат в 12 часов 55 минут. B 1 час 10 минут берется первая порция сока для переваривания палочки с сывороточным белком, по Метту, в течение получаса в водяном термостате. Каждые полчаса берутся дальнейшие порции и таким же образом испытываются на переваривание. В табл. 10 приведены числа переваривания и квадраты их как относительное содержание фермента. знакомились при белок свертывающей функции панкреатического сока. Во-вторых, измеряя и сопоставляя оба действия (6 последних чисел табл. 9 и второй ряд чисел табл. 10) разрушающегося панкреатического сока, мы убеждаемся, что на этот раз существует прямо не только параллелизм в отношении обоих деиствий, но и точная пропорциональность, прочем количество фермента мы вычисляем при молоко свертывающей функции прямо по числам времени, а при белок растворяющей по квадратам чисел миллиметров переваренного сывороточного белка.
III. Соки привратниковой части желудка и бруннеровского отдела двенадцатиперстной кишки
Наконец нами были испробованы на оба наши действия соки, изливавшиеся как из изолированной привратниковой части желудка, так и из изолированного отдела двенадцатиперстной кишки, в котором находятся брунннеровы железы. Соки добывались от собак спустя несколько месяцев и даже годов после операции фистул.
Во-первых, оказалось, что свертывающее молоко действис этих соков проявляется только в том случае, если они предварительно подкисляются, хотя бы потом и снова нейтрализовались, т. е. требуется активирование фермента кислотой. Это обстоятельство имеет существенное значение в нашем вопросе. Когда у авторов или эти соки, как они выделяются, или экстракты соответственных желез не оказывали никакого свертывающего действия на молоко, то в этом видели лишний довод за раздельность ферментов - свертывающего молоко и растворяющего белок.
Во-вторых, колебаниям переваривающей способности разных порций сока, в различные часы пищеварительной работы, также вполне отвечают колебания и в молоко свертывающем их детиствии. Надо заметить, что и мы, подобно многим другим авторам, видели растворяющее белки действие пилорического и бруннеровского соков только при подкислении их; при щелочной реакции, как они выделяются, эти соки неделями стояли в термостате без следов белок растворяющего действия. Параллелизм обоих действий соков вполне выступает в прилагаемой таблице (11).
Наконец абсолютная величина молоко свертываюшего действия пилорического и бруннеровского соков вполне отвечает белок растворяющему их действию. В то время как белок растворяющее действие желудочного и поджелудочного соков, в их наиболее концентрированных сортах, приблизительно одинаково велико и вообще значительно, и молоко свертывающее действие их также большое и приблизительно равное. Белок растворяющее действие пилорического и бруннеровского соков резко меньше, равняется или даже меньше действия самых слабых сортов желудочного и поджелудочного соков. В совершенном соответствии с этим и молоко свертывающее действие первых соков также относительно слабое. Привожу таблицу (12) одного из относящихся сюда опытов.
В первом столбце (табл. 12) мы имеем обозначение сортов сока: из пепсиновых желез изолированного желудочка, разбавленный в 4 раза водой, затем сок из изолированной привратниковой части желудка, далее сок из изолированного отдела двенадцатиперстной кишки с бруннеровыми железами и, наконец, такой же сок другой собаки. Последние три сока разбавлены в 3 раза 0.5% раствором соляной кислоты. Разбавление всех соков сделано с таким расчетом, чтобы все они имели кислотность около 0.1%. 0/ Во втором столбце приведена переваривающая сила в миллиметрах белковой палочки. В третьем столбце имеются квадраты чисел, выражающих переваривающую силу. B четвертом - стоят цифры, обозначающие, во сколько раз больше содержится фермента в каждом соке сравнительно со слабейшим, который принят за единицy. Пятый столбец содержит эквивалентные по содержанию фермента количества разных соков. В шестом - количества 0.5% соляной кислоты, прибавленной к порциям соков предшествующего столбца, чтобы все эти порции содержали одинаковое количество кислоты. Расчет делался на основании предшествующего точного титрования исходных разбавленных соков. В седьмом - приведено количество воды, прибавленной к предшествующим порциям, чтобы уравнять во всех них общую массу жидкости. Таким образом приготовленные порции разных соков приливались каждая к 10 куб. см молока. Они свернули молоко в число минут, которые приведены в столбце восьмом. Беря крайние числа из этого столбца, находим, что они разнятся друг от друга в полтора раза. Если бы все наши порции свернули молоко в одно и то же время, то это значило бы, понятно, что их белок свертывающее действие точно пропорционально молоко растворяющему. Набоюдавшееся расхождение чисел в полтора раза надо считать очень незначительным, почти не ослабляющим вывода о пропорциональности действий. Надо принять, во-первых, во внимание, что сопоставлялись по молоко свертывающему действию соки, которые по содержанию белок растворяющего фермента в крайних случаях разнились в 25 раз. Во-вторых, растворяющее действие соков, стоящих более близко к нашей таблице, очень мало, а это обыкновенно ведет к ошибке при счете миллиметров, и именно в сторону уменьшения; на числах же свертывания совершенно ясно, что они уклоняются от равенства первым тем больше, чем меньше переваривающая сила порции. Мы не сомневаемся, что при более точном определении переваривающей силы этих соков мы получим совершенно такой же результат, который приведен выше при такой форме опыта над тремя сортами сока из пепсиновых желез. Во всяком же случае на основании этих опытов бесспорно и сейчас, что молоко свертывающее действие пилорического и бруннеровского соков отвечает вполне их белок растворяющему действию, т. е. молоко свертывающее действие их приблизительно в столько же раз меньше соответствующего действия сока из пепсиновых желез, во сколько белок растворяющее действие меньше соответствующей величины сока из пепсиновых желез.
Итак, мы видим, что в четырех пищеварительных жидкостях, обнаруживающих белок растворяющее действие, имеется всегда и молоко свертывающее действие и притом соответствующего первому действию размера. В каждом из них оба действия идут всегда параллельно при всевозможных физиологических условиях работы желез. Эти действия, что касается их скрытого или проявленного состояния, относятся совершенно одинаково, находясь в одинаковой фазе и проявляясь всегда одним и тем же агентом и приблизительно с одной и той же быстротой. При сохранении соков и разрушении их под влиянием температур - низких, как и более высоких, а также при разрушении соков некоторыми агентами оба действия все время относятся совершенно параллельно. Более того, там, где удалось произвести более точные исследования, обнаруживалась и точная пропорциональность.
На основании всего вышеприведенного мы получили право допускать, что оба действия зависят от одного и того же химического агента, суть различные реакции одного и того же фермента.
Но как же отнестись к тем фактам, которыми до настоящего времени устанавливалась обособленность ферментов для двух исследуемых нами физиолого-химических действий?
Очевидно, ввиду нового материала, эти факты надо было вновь проконтролировать и обсудить, тем более, что без труда можно было усмотреть несколько источников ошибок в старых заключениях. Хотя дело касается и более или менее известных фактов, но эти факты не были достаточно оценены при сравнительной методике определения молоко свертывающего и белок растворяющего действия.
Эти факты следующие. Обыкновенно принимается, что количества фермента, свертывающего молоко, относятся обратно пропорционально, как времена свертывания; но нетрудно убедиться, как это и заявляется некоторыми авторами, что для применения этого правила наступает предел в случае слабых растворов фермента. Это особенно скоро обнаруживается при натуральных растворах фермента, т. е. в различных соках.
Привожу таблицу (13) соответствующих опытов с нейтрализованными NaHCO3 хлебным и молочным желудочными соками.
Очевидно, к влиянию предела надо отнести вышеотмеченное резкое падение свертывающего действия в молочном соке сравнительно с другими сортами.
То же самое получается при панкреатическом соке и тем более при пилорическом и бруннеровском соках, представляющих самые слабые растворы фермента. Таким образом очень легко потерять из глаз фермент, на самом деле несомненно существующий в среде.
Второе обстоятельство, игравшие роль в рассматриваемом нами вопросе, - это разрушающее действие щелочей (о своеобразности этого действия речь еще впереди), даже соды, действие давно хорошо известное. Как показано выше, даже тщательное нейтрализование, ни разу не переходящее за пределы нейтральной реакции Na2CO3, постоянно связано с разрушением фермента; и только при такой же нейтрализации NaHCO3 фермент может быть полностью сохранен. Так как это различие большею частью не принималось во внимание, причем не только не преследовали идеальной нейтрализации, аопускали небольшой перевес щелочной реакции, стараясь вполне отграничить ферментное свертывание от кислотного, то неизбежно должно было существовать значительное разрушение фермента.
Оба приведенные обстоятельства, соединяясь вместе, легко подделывали как бы исчезание того фермента, к которому относили молоко свертывающее действие. Это, очевидно, было причиной того, что у Гамарстена при стоянии искусственного желудочного сока в термостате растворяющее действие оставалось, а свертывающее исчезало, т. е. как бы происходило разделение ферментов. То же видели и мы при этих условиях в натуральном соке, когда мы испытывали его на свертывание после нейтрализации содой.
Ясно, что для исследования обоих действий были взяты методы совершенно различной чувствительности, нисколько между собой ни сопоставленные, ни соразмеренные. Для растворяющего действия применялся большей частью чувствительнейший реагент - фибрин, реагент без какого-либо предела. Для свертывающего действия пользовались нейтрализованным соком, при котором очень быстро с уменьшением количества наступает предел действия, тем более, что авторы брали совершенно произвольно предельное, вообще короткое, время свертывания, очевидно, боясь самопроизвольного подкисления молока. Простой пример бесспорно доказывает это: возьмите крепкий хлебный сок, разбавьте его в несколько сот, даже тысяч раз и вы все же получите довольно быстрое растворение им фибрина - в час, полтора, два. И тот же хлебный сок, нейтрализованный NaHCO3 и разбавленный только в 10-20 раз, даст вам свертывание только после многих часов, а дальше разбавленный не свернет молока и совсем. А между тем очевидно: фермент, свертывающий молоко, никуда исчезнуть из него не мог, не разрушился, и присутствие его там легко можно доказать, сделав благоприятными условия реакции свертывания. Из сказанного ясно, что при правильной методике определения свертывающего действия фермента обязательно повышать чувствительность реакции свертывания, прибавляя или к испытуемым жидкостям, или к молоку вещества, ускоряющие свертывание, как: кислоты, соли кальция, бария и т. д. Конечно, сравниваемые порции испытуемых соков должны быть тщательно уравниваемы в отношении повышающих чувствительность реактивов, самостоятельное, свертывающее действие этих агентов, если таковое существует, должно быть всегда контролируемо. Никакой запутанности из применения такой методики не произойдет, потому что благоприятствующие свертыванию условия действуют, как мы увидим ниже, по определенным правилам. Когда ферментное свертывающее действие в данной среде ослабевает, то усилить это действие только увеличиванием количества жидкости, приливаемой к молоку, удается только до известного предела, потому что рядом с увеличиванием количества фермента в молоке начинает давать себя знать разжижение молока, конечно, резко понижающее способность его свертываться. Когда желудочный сок, стоя в термостате, постепенно разрушается и, нейтрализованный содой, все медленнее свертывает молоко, то сначала вы помогаете делу, увеличивая количество прибавляемого сока к молоку. Но затем, когда вы достигаете трех, четырех куб. см на 10 куб. см молока, этот прием начинает вам отказывать, а в это же время употребление кислого сока в количестве 0.5--1.0 куб. см дает вам свертывание еще в течение нескольких минут или десятков минут. Что в этом случае кислота вас не обманывает, что вы дейстительно имеете перед собой еще ферментное действие, только без кислоты не обнаруживающееся, - это доказывает простейший контрольный опыт. Стоит вам слабый сок нагреть до 70°, to и 1 куб. см его свернет молоко только после десяти часов стояния в термостате, совершенно так, как это сделал бы 1 куб. см 0.5% соляной кислоты.
Третье обстоятельство, недостаточно оцениваемое при методике сравнения молоко свертывающего и белок растворяющего действия различных ферментных препаратов, - это указанное выше задерживающее действие солей и многих других веществ на реакцию растворения белка, отнюдь не простирающееся на молоко свертывающее действие.
Очевидно, на этом обстоятельстве основан главным образом фабричный прием изготовления препаратов сычужного фермента. Одному из нас (И. Павлову) живо припоминается следующее: когда впервые явилась мысль о тождестве химозина и пепсина, профессор Ненцкий возразил против этой мысли фактом, передавая имевшийся у него препарат сычуга из Рижской фабрики и предлагая показать ему в нем пепсинное действие. Жидкости в высшей степени энергично свертывала молоко, но, как мы ее ни подкисляли и ни разжижали (от 2 до 10 раз), фибрин в ней не только не переваривался, но даже уплотнялся.
В то время так и не удалось разрушить это возражение. Только позже, уже после смерти дорогого товарища, оказалось, что задача в данном случае была совсем легкая. Стоило разбавить этот препарат в 100 раз соляной кислотой 0.2%, и он переварил даже яичный вареный белок -- 1.3 мм за 10 часов (Мэтт). Рассчитывая переваривающую силу самого фабричного препарата по правилу Шюца и Борисова, ее надо было определить в 13 мм, что вполне отвечало бы огромное свертывающей силе этого препарата. Что здесь все дело заключается в прибавлении к экстракту сычужного желудка какого-то задерживающего вещества, доказывается следующею вариациею опыта (табл. 14).
То же самое мы получили и на многих других испытанных нами продажных препаратах сычужного фермента, в которых слабое или совсем отсутствующее растворяющее белки действие достигало размера, соответствующего молоко свертывающему действию их, раз только применялся прием надлежащего их подкисления и разжижения.
Надо думать, что, вследствие недостаточной оценки первого и третьего из перечисляемых обстоятельств, и совсем недавно предложенный метод, долженствующий доказать обособленность белок растворяющего и молоко свертывающего проферментов, метод Глэснера [58] отнюдь не достигает цели. Мы многократно применяли этот метод, строжайше следуя указаниям автора, и, однако, ни разу не достигли ни малейшего действительного разделения ферментов. Мы варьировали количество употреблявшихся для образования осадка уксуснокислого уранила и фоссернокислого натра, как только возможно, и имели все степени захватывания фермента осадком. При большом осадке фильтрат от него не обнаруживал никакого действия, зато оба действия оказывались в извлечении из осадка. При небольшом осадке совершенно наоборот. Случаи средних осадков дали все переходы между этими крайностями. Прилагаю таблицу (15).
По нашему мнению, фактически противоречие результатов наших и Глэснера имело свое основание в том, что он, во-первых, в фильтрате не считался с задерживающим действием на реакцию растворения образующегося уксуснокислого натра (см. табл. 6), во-вторых, для свертывающего действия был взят совершенно произвольный и очень ограниченный предел - свертывание литра молока в 30 минут. Представим себе такой случай: пусть с осадком захвачено 43-44 фермента, а в фильтрате осталось или 9/4 3/ его. Уксуснокислый натр почти совершенно мешает обнаружиться растворяющему действию фермента, так что проявляется только одно молоко свертывающее действие. Извлеченный из осадка фермент, благодаря разбавлению извлекающею жидкостью, освободился из-под влияния уксуснокислого натрия, т. е. снова стал растворять белок в значительной степени. Молоко же свертывающее действие экстракта, вследствие значительного разжижения, оказалось за пределами данной методики.
Точно таким же образом при точной проверке оказался недостигающим цели и второй метод Гамарстена. Он, как известно, начинается с многократного взбалтывания искусственного сока с порошком углекислого магния, при этом, по автору, пепсин должен был из жидкости увлекаться порошком, а химозин оставаться в жидкости, и затем следовала дальнейшая процедура очищения химозина. Мы проделали первую фазу методики с натуральным желудочным соком и видели то, что было перед глазами у Гамарстена. Фильтрат (3-й, 4-й и 5-й), хотя и меньше нормальной жидкости, но все же значительно быстро свертывал молоко, между тем как подкисленный до нормальной кислотности (0.5) без разжижения или только при малом разжижении совершенно не переваривал сырого фибрина даже за целые сутки. Однако стоило только разбавить фильтрат в 5-10 раз кислотой 0.1-0.2 для того, чтобы растворяющее действие фибрина обнаружилось совершенно отчетливо. И сколько раз мы ни взбалтывали наш предварительно нейтрализованный сок с углекислым магнием, мы не могли получить такого фильтрата, который при указанных условиях был бы лишен растворяющего действия на фибрин. Таким образом исчезнувший было параллелизм обоих действий для нас восстановился и мы было сочли себя удовлетворенными. Впоследствии, когда мы вместо параллелизма стали настаивать на пропорциональности, хотя бы приблизительной, этот пункт представил нам огромные затруднения и вызвал было даже в нас горькие сомнения относительно основного нашего положения, хотя это было в конце длиннейшего ряда фактов, нами полученных и до тех пор нам благоприятных. Когда мы попробовали более точно сопоставить молоко свертывающее и белок растворяющее действие фильтрата после взбалтывания с углекислым магнием, мы не могли не видеть огромной непропорциональности в обоих действиях. В то время как молоко свертывающее действие фильтрата указывало на уменьшение фермента в несколько раз, самое большее - в несколько десятков раз, по белок растворяющему действию фермента в жидкости оставалось в несколько сот и даже тысяч раз меньше. Мы обратили внимание на все мыслимые для нас обстоятельства. Мы определили и устранили задерживающее влияние на растворение того хлористого натрия, который образовался при нейтрализации сока. Мы определили и приняли во внимание благоприятствующее свертыванию молока действие того небольшого количества углекислого магния, которое растворялось в нашей жидкости при взбалтывании. Мы испробовали всякие степени кислотности, но факт в общем оставался прежним. Указанные меры изменяли результат только очень незначительно. Однако при этом постепенно накоплялись наблюдения, направлявшие мысль в надлежащий пункт. Титруя последовательные фильтраты, мы заметили, что их щелочность (вследствие небольшого растворения углекислого магния с щелочной реакцией) постепенно возрастает до известного предела, а с нею вместе понижалось белок растворяющее действие фильтрата. Это наводило на мысль: не играет ли в данном случае роль именно щелочность фильтрата? Поэтому прежде всего мы обратились к осадку углекислого магния после взбалтывания: действительно ли с ним увлечен из жидкости пепсин? Растворив этот осадок в соляной кислоте, разжижив его в надлежащей степени, чтобы устранить задерживающее действие хлористого магния, и подкислив соответственно, мы легко и точно на многих опытах убедились, что значительного захватывания пепсина осадком не происходило. Полученный раствор обнаруживал ничтожные следы растворяющего и молоко свертываютего действия, сравнительно с фильтратом. Стало действительно ясно, что механизм наблюдавшихся явлений в первой фазе гамарстеновского метода совершенно не тот, каким его представляли до сих пор. Это было давно известное разрушение фермента щелочью, разрушение или какое-то химическое изменение фермента под влиянием щелочи. Но если свойства фильтрата и были результатом действия щелочи, то все же, ввиду факта расхождения наших действий в фильтрате, приходилось думать так, что щелочь сильнее разрушает фермент, растворяющий белок, чем фермент, свертывающий молоко. Однако, принимая во внимание некоторые особенности, бросившиеся нам в глаза, когда мы занимались опытами с разрушающим действием щелочей на ферменты желудочного сока, мы продолжали стоять на своей точке зрения и старались добиться восстановления пропорциональности между обоими действиями, которая нам так упрямо не давалась. Наконец наше упорство было награждено: при, повидимому, совершенно ничего не значащей вариации опыта наш фильтрат проявил, наконец, растворяющее белки действие, нисколько не меньшее, а скорее большее, чем какое можно было ожидать на основании его молоко свертывающего действия. До сих пор мы Фильтрат, сделавшийся щелочным от взбалтывания с углекислым магнием, для переваривания сразу делали кислом до известной степени. Теперь же мы сперва его только нейтрализовали, таким оставляли стоять некоторое время и лишь затем подкислили до той же степени. И в этом-то фильтрате обнаружилось давно желанное значительное растворяющее действие (табл. 16).
Таким образом (табл. 16) и в этом приеме Гамарстена не оказалось ни малейшего намека на разделение фермента. Такой результат переисследования первой фазы приема естественно исключал надобность изучения второй фазы.
Самый же факт, обнаружившийся неожиданно ири этом, конечно, был достоин всяческого внимания. Мы имели перед собою под влиянием щелочной реакции переход фермента из деятельного состояния в недеятельное, из явного в скрытое, причем теперь обратный переход - из недеятельного в деятельное состояние - требует некоторой продолжительности нейтральной реакции среды (каковая и делалась молоком). Специально относительно этого пункта нами было сейчас же поставлено несколько опытов, один из которых приводим здесь (табл. 17).
При этих опытах нельзя не заметить, что при подкислении щелочной жидкости в один прием жидкость мутится и дает осадок, чего не бывает в случае, когда подкисление ведется в две фазы, c значительной остановкой (в несколько часов) на нейтральной реакции. Так как ясно, что факт стоит в ближайшем отношении к различным вопросам, касающимся фермента: действия щелочей, различного состояния фермента и т. д., то его изучение составило предмет дальнейшего и сейчас ведущегося в лаборатории исследования.
Весь изложенный материал, как нам кажется, отнимает всякую почву у ходячего мнения, что белки растворяющее и молоко свертывающее ферментные действия принадлежат особым ферментам. Факт тот, что эти действия никогда прочно не разделимы ни в организме, ни вне его ни при каких условиях. Есть, понятно, еще некоторые частные указания на прочную раздельность действий, но, не проверив их еще до сих пор, мы считали себя, однако, вправе не придавать им особенной силы ввиду обнаруженных нами недостатков современной методики сравнения этих действий.
Но мы давно уже остановились на общем вопросе: не противоречит ли нашему выводу, что оба исследуемые действия принадлежат одному и тому жерменту, то обстоятельство, что эти действия обнаруживаются по двум различным правилам зависимости от количества фермента? Это же представлялось существенным возражением против нашего взгляда и Гамарстену, что мы прочли уже во время писания этой статьи в последнем издании его учебника физиологической химии.
Наши обе реакции - растворение белка и свертывание молока - во всяком случае разные реакции, а если это так, то нет никакой необходимости в тождестве правил количественной зависимости времени реакции от концентрации ферментов. Скорость реакции определяется условиями реакции, которые то увеличивают, то уменьшают скорость. Соответственно характеру условий должны изменяться и правила зависимости скорости реакции от количества фермента в данном случае. С целью получить фактический материал, подтверждающий это, мы поставили несколько рядов опытов, где, меняя условия реакций, достигли соответствующего изменения правил. Нейтральный раствор молоко свертывающего фермента, раз он находится в жидкости в известной достаточной концентрации, свертывает молоко по правилу обратной пропорциональности между количествами фермента и временами свертывания. Хотя это давно известно, но мы позволяем себе, ради наглядного сравнения с последующим, привести таблицу (18), относящуюся к этому опыту.
Если мы берем кислый раствор того же фермента и прибавляем различное количество его к молоку, то теперь мы изменяем в молоке в совершенно той же пропорции количество как фермента, так и кислоты, т. е. если мы, например, увеличим вдвое количество фермента, то вместе с тем увеличиваем вдвое и количество кислоты в нем.
В таком случае первое правило обращается во второе: именно теперь количества фермента относятся обратно пропорционально, как квадратные корни их времен свертывания, т. е. реакция правильно ускоряется. Привожу таблицу (19).
Совершенно то же самое наблюдается и вом случае, если в растворе фермента имеются соли, ускоряющие свертывание. Если, например, натуральный желудочный сок нейтрализовался углекислым барием и такая нейтрализованная жидкость приливается в разных количествах к молоку, то она также свертывает молоко по второму правилу. Приводим таблицу (20).
Наконец, если взять значительно разведенный нейтральный раствор фермента и приливать его к молоку разными, но большими количествами, чтобы избежать предела, то часто наблюдается действие третьего правила: количества ферментов относятся теперь, как квадраты времен свертывания. Очевидно, разведение молока, идущее строго пропорционально вместе с увеличением фермента, правильно замедляет скорость реакции. Приводим таблицу (21).
Совершенно так же и правило растворения белка в зависимости от количества фермента может видоизменяться, смотря по условиям реакции. Обыкновенно в известных пределах концентрации фермента количество фермента связано с действием числом миллиметров переваренной белковой палочки (по Месту) за одно и то же время - правилом прямой пропорциональности между количеством фермента и квадратом числа миллиметров. Опять для наглядного сравнения приводим таблицу (22).
Если же, беря слабые сорта сока, разбавлять его не кислотой, как делалось в предшествующем опыте, а водой, то связь количества фермента с действием (числом миллиметров переваренной белковой палочки) определяет новое правило, правило прямой пропорциональности между количеством фермента и числом (а не квадратом его) миллиметров переваренной белковой палочки. Приводим таблицу (23).
Последнее отношение уясняет основной смысл и первого правила, относящегося до реакции растворения белка. Очевидно, когда мы кислотой разбавляем данный раствор фермента, мы изменяем не один фактор, как нам казалось раньше, - именно концентрацию фермента, а два: кроме изменения количества фермента в среде, мы изменяем, - именно правильно увеличиваем, - количество кислоты относительно фермента, чем правильно ускоряем реакцию. При разведении же водой действительно изменяется в среде тольколичество фермента, отношение же концентрации фермента к концентрации кислоты остается постоянным, т. е. реакция не испытывает ускоряющего влияния. Это и будет случай реакции растворения белка, совершенно аналогичный обыкновенному случаю свертывания молока чистым нейтральным раствором фермента.
Таким образом казавшееся существенным возражение потеряло свою силу. Самый же факт варьирования правил зависимости действий фермента от количества, смотря по условиям, конечно, требует более широкого и систематического исследования, так как все эти правила ограничены определенными пределами.
Не незначительным общим подтверждением правильности руководящей идеи работы служит, помимо всех приведенных частных фактов, и то, что преследование этой мысли, и именно там, где, повидимому, сначала положение дела было решительно против нее, привело к находке новых фактов значительной важности.
По всему приведенному продолжать думать, что оба наши действия исходят от разных ферментов, но всегда в организмах, встречающихся вместе, и притом в одних и тех же количественных отношениях, было бы только привычкой к старому выводу, лишившемуся в настоящее время своих оснований.
Таким образом мы утверждаем, что оба действия принадлежат одному и тому же ферменту. Как понимать эту двойственность действия одного и того же фермента?
Конечно, первый пункт, с которого надо начинать, касается реакции свертывания молока: чтоно такое физиологически и химически? Нельзя не признать, что реакция эта долгое время была совершенно загадочной, что касается ее физиологического смысла. Если у млекопитающих животных она могла быть до известной степени истолковываема как выгодная или надобная при обработке молока в пищеварительном канале, то у всех остальных животных и растений, где совсем не встречается субстрата для молочного фермента, назначение ее было совершенно темно. Мне кажется, в этом нельзя не видеть яркого примера бесстрастного и, конечно уж, незаконного объективизма, который спокойно проходит около в высшей степени курьезного факта, не задаваясь, повидимому, необходимым вопросом: для чего же существует в том или другом животном или растении молочный фермент, который никогда не встречается с молоком? При настойчивой постановке такого вопроса неизбежно следовало бы заключение, что свертывание молока есть частное, для экспериментатора как бы случайное, обнаружение какой-то общей реакции. Честь такого заключения по справедливости, по моему мнению, должна быть приписана профессору А. Данилевскому, который в свертывании молока видел усложнение белковой частицы, обратное тому упрощению, которое наступает при действии белковых ферментов, как пепсин и т. д. И действительно, в соответствии с этим, ему удалось, вместе с учеником его Окуновым, показать и осаждение некоторых альбумоз препаратом сычужного фермента. В самом деле, что могло бы говорить против предположения, что свертывание молока есть наиболее простая стадия из длинного синтеза белковых тел? Против серьезного ничего, а за - нечто есть. Казеин и параказеин всеми признаются за очень близкие химические тела. А между тем, в той же обстановке, одно остается творе, а другое осаждается. Вполне естественно думать в таком случае о более сложной частице второго вещества. Этому представлению в высшей степени благоприятствуют только что опубликованные опыты Ловенгарта. [59] Теперь, когда у старого мнения, что белок растворяющее и молоко свертывающее действия принадлежат разным ферментам, отнято всякое основание, представляется самым естественным думать, что обе реакции суть обратимые реакции белкового фермента. Если предвидимая уже теоретически обратимость ферментных реакций вполне подтвердилась на жировых и углеводных ферментах, то почему бы белковый фермент представлял исключение? А если она должна быть и у него, то зачем ее искать далеко, когда у того же белкового фермента есть загадочная сторона действия, всего проще понимаемая именно с этой точки зрения.
Надо думать, к этой же категории явлений принадлежат и свертывание крови и желатинизирование панкреатического сока, описанные в работе доктора Линтварева.2 [60] Если в зимогенный панкреатический сок, содержащий много белка, прибавляется киназа, то сок превращается часто быстро в такой прозрачноплотный сгусток, что пробирку можно перевернуть вверх дном без того, чтобы содержимое ее вылилось.
Смеем думать, что с признанием обратимых реакций белковых ферментов, которых мы имеем теперь целый ряд, вероятно для различных стадий разложения белка, биологическая химия выйдет на прямую дорогу, ведущую к разрешению ее важнейшего вопроса о синтезе белкового вещества.
Помимо указанного общего значения, доказанная принадлежность обеих наших реакций одному и тому же ферменту обещает большое методическое применение, которым мы уже не раз и пользовались. Для определения количества белкового фермента молоко свертывающее действие представляет огромные выгоды сравнительно с реакцией растворения белка. Она протекает гораздо быстрей, лучше измерима и менее зависима в химическом отношении (более проста).
Мы не приводим обширную литературу по свертыванию молока, потому что не имеем претензии на открытие какихлибо новых фактов, к свертыванию молока относящихся. Центр тяжести нашей работы лежит в применении давно известных фактов к улучшению сравнительной методики исследования белок растворяющего и молоко свертывающего ферментов.
Но зато мы не хотели бы оставлять неясности относительно независимости нашей мысли о тождестве ферментов, свертывающих белок. Появившееся в заграничной прессе раньше заключение Зибера и Ненцкого, 1 [61] с одной стороны, и Пекальхаринга,2 [62] 2 с другой, - о тождестве химозина и пепсина, во-первых, есть нечто другое: эти авторы допускают, так сказать, частичное тождество этих ферментов, принимая разные добавочные группы для каждого отдельного фермента. К тому же почти никаких доказательств (кроме беглого указания на немногие случаи параллелизма) ими не было приведено в пользу этого заключения. Скорее это заключение нужно было авторам для того, чтобы иметь право говорить о полученном ими продукте из натурального желудочного сока, как о химическом индивидууме. Во-вторых, один из нас (И. Павлов) высказал мысль о тождестве этих ферментов в том смысле, как она развита в настоящем исследовании, ранее публикации упомянутых авторов. 3 [63] Заметка эта вызвана тем, что некоторые авторы считают нашу основную мысль и наши данные дальнейшим развитием заключений вышеприведенных авторов.
Приведенные выше результаты нашей работы в коротких сообщениях были заявлены в нескольких заседаниях Общества русских врачей 1902 и 1904 гг., на Съезде натуралистов в Гельсингфорсе в 1902 г. и на Международном съезде в Мадриде в 1903 г.
В постановке последних опытов относительно пропорциональности обоих действий большое участие принимал доктор Н. П. Тихомиров, за что мы приносим ему нашу искреннюю благодарность.