Если результат теста положителен с C(t) около 34, но симптомов у тестируемого нет, то либо они появятся в ближайшее время, либо этот человек относится к загадочной группе асимптоматиков, либо он уже выздоравливает, но на симптомы внимания не обратил, так как они были слабыми. Но в любом случае на момент, когда этот человек сдавал тест, он не представлял опасности для других людей. Чтобы понять, что с ним делать, опять же имеет смысл повторить тест через 24 часа и посмотреть на динамику. Если второй анализ даст положительный сигнал, скажем, на 25-м цикле — вирус активно размножается и пациент находится в опасной для окружающих фазе болезни. Если же второй результат вновь покажет C(t)=34 или вовсе будет отрицательным — пациент не заразен.
В среднем отличие C(t) в 3,3 цикла указывает на десятикратную разницу в исходной концентрации вирусных нуклеиновых кислот. Иначе говоря, в образце, который дал положительный сигнал на 25-м цикле, в 10 раз больше РНК коронавируса, чем в образце, в котором положительный сигнал проявился на 28-м цикле. Зная это и крайнее значение C(t), выше которого образец условно считается чистым, можно гораздо точнее интерпретировать положительные результаты РНК-теста. Однако такая практика не применяется для массового тестирования, и итоги генетического анализа рассматривают бинарно: либо «да», либо «нет» — очевидно, потому, что так проще при большом потоке образцов. Причем за стандартную границу, которая отделяет положительный и отрицательный результаты ПЦР-теста часто принимают C(t)=40, что, безусловно, избыточно: так как полимераза всегда работает с ошибками, да и праймеры могут иногда «прилипать» к нецелевым фрагментам, на 40-м цикле накапливается множество посторонних фрагментов, которые способны дать ложноположительный сигнал. Возможно, в будущем чиновникам от здравоохранения придется пересмотреть систему оценки результатов, в противном случае будет крайне сложно организовать массовое тестирование, которое позволило бы странам не жить в режиме вечного карантина, а вернуться к нормальному существованию. Мы подробнее обсудим этот момент в главах 11 и 12.
На самом деле все несколько сложнее, и на разных машинах для проведения ПЦР одно и то же исходное количество РНК может давать сигнал на разных пороговых циклах. В идеале следует перед началом массовых анализов калибровать все приборы, определяя, какой C(t) соответствует опасному с точки зрения заражения количеству РНК в образце. К осени 2020 года в научном сообществе сложился консенсус, что оно составляет около миллиона копий на образец.
Пока же принято считать, что положительный результат ПЦР-теста образца, взятого из полости носа, ротоглотки или, реже, носоглотки, говорит, что человек заражен коронавирусом, даже если C(t) далеко за 30. И наоборот, у не болеющих прямо сейчас и контактировавших с больными за доказательство чистоты принимают отрицательный результат одного теста. У тех, кто болел, критерием выздоровления считают два отрицательных результата, полученных с интервалом в несколько дней при отсутствии клинических симптомов. Впрочем, постепенно от этой практики отказываются, и если у человека с подтвержденной ранее коронавирусной инфекцией с момента появления симптомов прошло более десяти дней, а сами симптомы исчезли, его могут вычеркнуть из списка болеющих и без второго теста[320]. Отсутствие симптомов критически важно: так как по мере прогрессирования болезни SARS-CoV-2 спускается из верхних дыхательных путей в нижние, на второй-третьей неделе болезни вирусная РНК в мазках из глотки может не определяться, хотя коронавирус замечательно размножается в легких и может загнать пациента в реанимацию. Самое неприятное, что эту ошибку (приравнивать отрицательный тест к отсутствию вируса в организме, а положительный — к его наличию) часто допускают в исследовательских статьях. Именно поэтому так важно вчитываться в детали проведенных экспериментов, а не только в громкие заголовки публикаций в СМИ.
В нескольких работах было показано, что концентрация вирусной РНК в слюне не так сильно зависит от времени проведения теста[321],[322], так что ее анализ может стать хорошей альтернативой стандартному тестированию образцов из глотки (заодно это здорово облегчит проведение тестов у детей, которым категорически не нравится процедура взятия мазка из глотки). Возможно, в будущем такие тесты станут нормой в массовой практике, пока же все еще используется стандартный протокол. И причина не в том, что ученые как-то особенно упрямы или не читают статей коллег. Просто для валидации тест-системы, в которой в качестве образца используется слюна, потребуется вновь проходить множество долгих процедур, а в условиях, когда каждый день нужно было проводить тысячи тестов, никто к этому не был готов. Летом, когда ученые и медики немного освоились с коронавирусной инфекцией, работа над новыми протоколами интенсифицировалась. Впрочем, у некоторых из существующих, но не валидированных тест-систем, которые используют слюну, есть еще один недостаток: они требуют довольно большого количества исходного материала — около 10 миллилитров, причем в идеале собирать образцы рекомендуется с утра, не ев, не пив и не чистив зубы[323]. Набрать такое количество слюны довольно затруднительно даже взрослым, для детей эта задача и вовсе может оказаться непосильной. Кроме того, густая — ведь человек не пил — слюна плохо пипетируется, что может повлиять на качество результата[324].
Теоретически в качестве образца для анализа на наличие вирусной РНК можно использовать кал — мы уже обсуждали, что SARS-CoV-2 может размножаться в кишечнике и выделяться с экскрементами. Но, во-первых, неясно, у всех ли зараженных это происходит, во-вторых, мы не знаем, какова динамика выделения вируса в зависимости от стадии болезни, и, в-третьих, содержащиеся в кале вещества могут мешать прохождению ПЦР[325].
Тест на антитела
Если РНК-тест выявляет активную стадию болезни, то серологический, он же тест на антитела, показывает, перенес ли человек COVID-19 в прошлом — хотя иногда может выявлять и текущую инфекцию. Как мы неоднократно обсуждали в предыдущих главах, когда в нас проникает патоген, организм мобилизует для защиты от него иммунную систему. Если повезет, она задавит врага силами врожденного иммунитета, которые неспецифично убивают самых разных «вторженцев». И только когда это не поможет, начинает раскручиваться махина адаптивного иммунитета, настраивающегося конкретно на этого паразита. Важнейшими игроками этой системы являются антитела — белковые молекулы, которые накрепко прилипают к какому-нибудь месту на поверхности патогена, маркируя его для клеток-пожирателей вроде макрофагов.
Первыми появляются антитела типа М{55} — они связываются с врагом не очень прочно и не слишком специфично. Иммуноглобулины типа G подтягиваются позже, так как им требуется время, чтобы «созреть»: благодаря хитрому процессу локальных мутаций в производящих эти антитела B-лимфоцитах каждое следующее поколение IgG прочнее прикрепляется к антигену (подробнее см. в главе «Что коронавирус делает с нами»). Однако в случае коронавируса разница в появлении IgM и IgG не слишком велика: оба типа антител начинают обнаруживаться в крови к концу первой недели после появления первых признаков COVID-19[326]. Но на этом этапе концентрация иммуноглобулинов слишком мала: стандартные массовые тесты стабильно определяют оба типа антител начиная с 14-го — 21-го дня[327]. Концентрация IgG и IgM увеличивается со временем (хотя и с разной скоростью) и выходит на плато примерно на 17-й –19-й день после появления симптомов[328].
Для того чтобы определить, есть ли в организме антитела к коронавирусу, у тестируемого берут кровь, отделяют сыворотку и капают ее в маленькую лунку на специальной прозрачной пластиковой плашке. В стандартной плашке 96 лунок, и ко дну каждой заранее приклеены антигены — в данном случае фрагменты различных белков SARS-CoV-2 (чаще всего используют фрагменты S- и N-белков). Если в сыворотке есть антитела против вирусных белков, они намертво прицепятся к антигенам в лунке. На следующем этапе плашку промывают от несвязавшихся иммуноглобулинов, а затем добавляют в лунки так называемые вторичные антитела, узнающие «ножки» любых человеческих антител: так как в плашке остались только антитела против белков коронавируса, вторичные антитела прицепятся именно к ним. Вторичные антитела модифицированы так, что их можно визуализировать: скажем, к их ножкам прикрепляют ферменты, которые при добавлении определенных веществ могут флуоресцировать. Через прозрачное дно плашки хорошо виден цветовой сигнал, и если он есть, значит, в исходном образце были антитела к белкам SARS-CoV-2. Такой метод определения каких-либо антигенов называется иммуноферментным анализом (ИФА) или, по-английски, ELISA (enzyme-linkjd immunosorbent assay, иммуносорбентный анализ с ферментной меткой).
Если с чувствительностью ПЦР-теста можно поиграть, выбирая для размножения тот или иной участок вирусного генома, то в случае серологических тестов важно, какие антигены будут закреплены на дне лунки. Когда там слишком много разных фрагментов, велика вероятность, что мы обнаружим антитела не только к SARS-CoV-2, но и к другим коронавирусам. У них много похожих белков, а небольшие пептидные фрагменты и вовсе могут оказаться одинаковыми. Тесты, которые плохо определяют отличия между близкими вирусами, называют малоспецифичными. Если ограничиться малым числом кусочков, тест, наоборот, может давать ложноотрицательный результат, потому что у человека не сформировались антитела именно к этим фрагментам. Говорят, что у таких тестов низкая чувствительность. Подробнее о чрезвычайной важности соотношения специфичности и чувствительност