Вирусы гриппа А от водных птиц плохо развиваются в клетках человека и наоборот. Однако вирусы как птичьего, так и человеческого гриппа могут реплицироваться у свиней. О восприимчивости свиней к вирусам гриппа, инфицирующих людей, мы знаем еще с тех пор, как ветеринар Дж. С. Коен впервые обнаружил свиней с симптомами гриппа, очень сходными с таковыми у людей. Ретроспективные исследования крови человека показывают, что вирус свиней, выделенный Шопом в 1928 году, был похож на вирус человека и, вероятно, сыграл роль в эпидемии среди людей. Свиной грипп персистирует круглогодично и является причиной большинства респираторных заболеваний свиней. Интересно, что в 1976 году вирус гриппа свиней, выделенный от призывников в Форт-Дикс, был неотличим от вирусных изолятов, полученных от людей и свиней на ферме в Висконсине. Исследователи пришли к выводу, что животные, особенно водоплавающие птицы и свиньи, могут быть резервуарами вируса гриппа. Когда такие вирусы или их компоненты смешиваются с вирусом гриппа человека, могут последовать радикальные генетические сдвиги, создающие потенциал новой эпидемии для людей.
Вирус гриппа постоянно эволюционирует путем антигенного сдвига и дрейфа. Ранние исследования в этой предметной области, проведенные Робертом Вебстером и Грэмом Лавером, установили важность мониторинга штаммов гриппа для прогнозирования будущих эпидемий39-41. Антигенные сдвиги – это важные изменения в структуре вируса гриппа, определяющие его взаимодействия с иммунной системой. Из вирусных белков гемагглютинин, главный гликопротеин вируса, играет центральную роль в инфекции, поскольку он отвечает за прикрепление к клеткам хозяина. Для инфицирования необходимо разделение гемагглютинина вируса на две более мелкие единицы. Изменения в составе гемагглютинина (H) или нейраминидазы (N), другого гликопротеина вируса гриппа, наблюдались во время эпидемий 1933, 1957, 1968 и 1977 годов:
1933: H1N1
1957: H2N2 (азиатский грипп)
1968: H3N2 (гонконгский грипп)
1977: повторное появление H1N1, называемое «русским гриппом»
Повторное появление в 1977 году вируса русского гриппа, имевшего почти полную генетическую идентичность с вирусами H1N1, которых было в изобилии в 1933 году, повышает вероятность того, что вирус сохранялся в каком-то неопределенном месте, вероятно, в замороженном состоянии.
Начиная с 1995 года Джефф Таубенбергер и его коллеги из Института патологии вооруженных сил в Вашингтоне, округ Колумбия, начали анализ легочных тканей людей, умерших во время пандемии гриппа 1918 года. В марте 1997 года часть нуклеиновой кислоты вируса гриппа была выделена из фиксированного формалином образца легочной ткани 21-летнего военнослужащего, погибшего во время пандемии гриппа в Испании в 1918–1919 годах15.
В течение следующих 10 лет с использованием коллекции дополнительных фиксированных формалином тканей и кусочка легочной ткани уроженца Аляски, умершего во время пандемии 1918–1919 годов и похороненного в вечной мерзлоте (подобно ткани, хранящейся в морозильной камере), был возрожден вымерший вирус гриппа 1918 года16, что явилось чудом молекулярной биологии и научной интуиции. Технология включала не только выделение РНК из пораженной ткани жертвы давней пандемии и создание копии ДНК на матрице РНК, но и независимое использование обратной генетики, сначала Питером Палезе из Медицинской школы Маунт-Синай в Нью-Йорке, а затем Йошихиро Каваока из Университета Висконсина. Сочетание этой технологии и творческих усилий ученых позволило восстановить активный реплицирующийся вирус гриппа пандемии 1918 года. Опять же, свою роль сыграла интуиция. Как сказал мне Джефф Таубенбергер, «завершив свое медицинское и исследовательское образование (в области иммунологии), я занял должность главы лаборатории молекулярной патологии в Институте патологии вооруженных сил США в Вашингтоне, округ Колумбия». Когда его руководитель попросил его спланировать, помимо его основного исследовательского интереса, иммунологии, проект с использованием образцов, хранящихся в Институте вооруженных сил, Таубенбергер решил использовать ткани из коллекции фиксированных формалином живых тканей, в изобилии хранящихся в Институте, для поиска геномных последовательностей вируса пандемического гриппа. Это не было новым подходом, так как исследователи из нескольких лабораторий занимались подобным поиском реликтовых микроорганизмов. Преимущество Таубенбергера заключалось в том, что он нашел образцы тканей времен пандемии гриппа 1918 года, не затронутые вторичными бактериальными инфекциями, которые могли бы повредить последовательности вирусной РНК.
Поскольку первые вирусы гриппа были выделены в 1930-х годах, характеристика штамма 1918–1919 годов основывалась на молекулярном определении вирусной РНК. Последующая реконструкция вируса гриппа, содержащего все восемь его субъединиц и с использованием обратной генетики для создания инфекционного вируса, дала новую и неожиданную информацию16,42-45. Во-первых, в отличие от вирусов гриппа пандемий 1957 и 1968 годов, у которых гены гемагглютинина и нейраминидазы были пересортированы с птичьими генами, гены H и N вируса пандемического гриппа 1918 года произошли из чисто птичьего источника и скрестились с человеческими после генетической адаптации. Таким образом, анализ генетической последовательности H1N1 пандемического вируса гриппа 1918 года по сравнению с последовательностями нескольких биологических видов показал происхождение от птиц, поскольку последовательность H1N1 была ближе к последовательностям птичьего H1N1, чем к последовательностям H1N1 человека. Последние гены отличались генетически на 25 изменений в последовательности белка от всех известных генов птичьего гриппа. Возможно, эти исходные последовательности у птиц больше не встречаются или представляет собой смесь последовательностей птиц, свиней, и человека. Однако за период 1918–1919 годов нет отчетов, где упоминались бы аномальная смертность или болезни среди водоплавающих или других птиц. Вирусологи-детективы сейчас обследуют на наличие вирусов гриппа коллекции птиц в Смитсоновском институте, составленные примерно в 1918–1919 годах.
Детальное исследование на молекулярном уровне показало, что реконструированный штамм вируса пандемического гриппа 1918 года связан с рецепторами α-2,6 сиаловой кислоты (рецептор гриппа человека), а не с рецептором α-2,3 сиаловой кислоты (рецептор птичьего гриппа). Более того, один ген H, выделенный из штамма 1918 года, связывается только с рецептором сиаловой кислоты α-2,6, тогда как второй изолят гена H связывается двойным образом с рецепторами сиаловой кислоты α-2,6 и α-2,3, что свидетельствует о смесях циркулирующих вирусов гриппа. Важно отметить, что возрожденный вирус гриппа 1918 года реплицировался в отсутствие добавления протеазы трипсина. Большинство молекул H патогенного вируса гриппа содержат сайт расщепления основных остатков и требуют расщепления внутри клеток-хозяев для репликации. Таким образом, для выращивания вирусов гриппа в культурах клеток вирусолог добавляет протеолитический фермент, такой как трипсин. Напротив, молекула H вируса пандемического гриппа 1918 года имеет один основной остаток и может реплицироваться в клетках без добавления трипсина.
Ни один ген вируса гриппа 1918 года сам по себе не объясняет его высокой степени патогенности. Следовательно, мы вынуждены сделать вывод, что летальный эффект вызван множеством вирусных генов (т. е. полигенный). Критерием этой глубокой летальности является то, что возрожденный вирус 1918 года в 100 раз смертоноснее других штаммов для инфицированных им экспериментальных животных. В некоторых случаях он реплицируется, производя на 39 000 вирусных частиц больше, чем другие штаммы гриппа, и вызывает серьезные повреждения легких у мышей и обезьян, очень похожие на повреждения легких людей, умерших от инфекции вируса гриппа 1918–1919 годов Кроме того, в отличие от других вирусов гриппа, возрожденный вирус 1918 года обладает летальным действием при введении куриным эмбрионам. Хотя многие из его генов могут участвовать в вирулентности, доминирующую роль, вероятно, играют гены гемагглютинина и полимеразы.
Другие ключи к разгадке вирулентности вируса гриппа 1918 года были получены в результате недавних исследований на обезьянах46. Заражение яванских макак современным штаммом гриппа привела к развитию слабо выраженных симптомов и минимальной патологии в легких. Напротив, возрожденный вирус гриппа 1918 года быстро распространился их легким животных и был смертельным. Особенно важным был исход заражения вирусом гриппа 1918 года, когда иммунная система обезьян выходила из строя, что вызвало повышенное производство белков хозяина, называемых цитокинами. Этот иммунопатологический эффект называется «цитокиновым штормом». Следствием является то, что такие производимые хозяином молекулы, в дополнение к поражению самим вирусом, ответственны за повреждение тканей и смерть. На счет цитокиновых штормов относят также тяжелые респираторные расстройства у людей, инфицированных возбудителями тяжелого острого респираторного синдрома или ханта-вирусами. Некоторые из этих цитокинов дают сигналы для миграции макрофагов и полиморфно-ядерных клеток, значительно усугубляющих разрушение легких с нарушением воздухообмена и дыхания17.
Популяции птиц содержат большие пулы вирусов гриппа A, потенциально способных вызывать новые пандемии гриппа47. Анализ генов гриппа, особенно H, позволяет предположить, что H-белок может отличаться от пандемического вируса 1918 года всего лишь несколькими аминокислотами15,16,43-45,47 и потенциально обеспечивать более опасное заболевание16,42,43. Чтобы предсказать возможные будущие пандемии и оценить риски, ученые