Cas9 станет надежной технологией для редактирования генома человека, то мир изменится”. Йинек боялся, что выполнить задачу будет нелегко. “У нас не было специалистов по редактированию генома в отличие от некоторых лабораторий, где работали пионеры этого метода, – говорит он, – и потому нам приходилось заново изобретать то, что другие уже сделали”[188].
Позже Даудна признала, что сначала пережила “множество провалов”, пытаясь наладить работу CRISPR-Cas9 в клетках человека[189]. Но когда начался осенний семестр 2012 года, а Чжан ускорил работу, чтобы быстрее закончить собственные эксперименты, ей улыбнулась удача. В лабораторию пришла новая студентка Александра Ист, которая имела опыт работы с клетками человека. Особенно любопытной была ее подготовка: она училась редактировать геном, когда была лаборанткой в Институте Брода, где работала с Фэном Чжаном и другими исследователями.
Ист сумела вырастить необходимые человеческие клетки и начала эксперименты по внедрению Cas9 в их ядра. Получив первые результаты, она не смогла однозначно сказать, свидетельствуют ли данные о том, что происходит редактирование генома. Порой результаты биологических экспериментов оказываются неочевидными. Но Даудна, у которой глаз был наметан, сочла эксперименты успешными. “Когда [Александра] показала мне данные, мне сразу стало ясно, что ей удалось получить прекрасные свидетельства редактирования генома в клетках человека с помощью Cas9, – говорит Даудна. – Этим студент, не завершивший обучение, отличается от человека вроде меня, который уже некоторое время работает в своей сфере. Я знала, что именно хочу увидеть, и стоило мне взглянуть на полученные ею данные, как что-то щелкнуло и я подумала: «Да, у нее получилось». Она сомневалась в этом и подозревала, что ей придется провести эксперименты снова, но я сказала: «О боже, это же здорово! Это просто замечательно!»”[190]
По мнению Даудны, данные свидетельствовали, что обеспечение работы CRISPR-Cas9 в клетках человека нельзя считать ни серьезным прорывом, ни новым изобретением: “Было хорошо известно, что можно пометить белки сигналами ядерной локализации, чтобы направить их в ядро, и именно так мы поступили с Cas9. Кроме того, было известно, как изменить кодоны в гене, чтобы белок лучше экспрессировался в клетках млекопитающих, и это мы тоже сделали”. Ей казалось, что в этом не было ничего особенно нового, хотя она и спешила первой достичь поставленной цели. Чтобы поместить ферменты в ядро клетки, достаточно было адаптировать методы, которые использовались ранее, например TALEN. Ист добилась этого за несколько месяцев. “Когда стало понятно, из каких компонентов состоит система, сложностей уже не возникло, – говорит Даудна. – С задачей справилась студентка первого года магистратуры”.
Даудна считала, что нужно как можно быстрее что-нибудь опубликовать. Она поняла – и поняла совершенно верно, – что, если другие лаборатории первыми покажут, что CRISPR-Cas9 можно поместить в клетки человека, это назовут важным открытием. Она настояла, чтобы Ист подкрепила свои данные повторными экспериментами. Йинек между тем искал способ превратить созданную ими в пробирке одиночную направляющую РНК в направляющую, которая сможет доставлять Cas9 к мишени в клетке человека. Было непросто. Оказалось, что полученная им одиночная направляющая РНК слишком коротка, чтобы максимально эффективно работать с человеческой ДНК.
Глава 26. Фотофиниш
Когда Фэн Чжан начал проверять возможность применения одиночной направляющей РНК, он обнаружил, что вариант, описанный в статье Даудны и Шарпантье, опубликованной в июне 2012 года, плохо работает в клетках человека. Он создал более длинную вариацию одиночной направляющей РНК со шпилькой, и такая вариация оказалась более практичной[191].
Модификация Чжана показала, в чем разница между работой в пробирке, по примеру команды Даудны, и работой в клетках человека. “Вероятно, биохимические данные убедили Дженнифер, что РНК не нужен этот дополнительный фрагмент, – говорит он. – Она полагала, что короткой одиночной направляющей РНК, созданной Йинеком, достаточно, поскольку в пробирке все работало. Я же знал, что биохимия не всегда может спрогнозировать, что на самом деле будет происходить в живых клетках”.
Чжан внедрил в систему CRISPR-Cas9 и другие изменения и оптимизировал ее для работы в клетках человека. Порой бывает сложно провести крупную молекулу сквозь мембрану, окружающую ядро. Техника Чжана включала маркировку фермента Cas9 последовательностью ядерной локализации, которая дает белку доступ к ядру клетки, куда иначе невозможно проникнуть.
Кроме того, Чжан применил известную технику “оптимизации использования кодонов”, чтобы обеспечить работу системы CRISPR-Cas9 в клетках человека. Кодоны – это трехбуквенные фрагменты ДНК, передающие инструкции о последовательности аминокислот, из которых состоят белки. Одну аминокислоту могут кодировать разные кодоны, причем в разных организмах с задачей наиболее эффективно справляются разные вариации кодонов. При попытке перенести систему экспрессии генов из одного организма в другой, например от бактерии к человеку, оптимизация использования кодонов позволяет заменить последовательность кодонов на наиболее подходящую.
Пятого октября 2012 года Чжан отправил свою статью редакторам Science, которые приняли работу к публикации 12 декабря. В списке авторов значились имена Шуайляна Линя, того самого постдока, который заявил, что у Чжана почти не наблюдалось прогресса, пока не вышла статья Даудны и Шарпантье, и Лучано Марраффини, посоветовавшего Чжану сосредоточиться на Cas9, но оставшегося за бортом при подаче заявки на патент. В статье описывались проведенные эксперименты и полученные результаты, а завершалась она весьма эффектным и значимым предложением: “Способность осуществлять мультиплексное редактирование генома в клетках млекопитающих может найти широкое применение в фундаментальной науке, биотехнологической отрасли и медицине”[192].
Двадцать пять лет Джордж Черч занимался различными методами редактирования генома. Он учил Фэна Чжана и формально оставался научным руководителем его ведущего соавтора, Лэ Цуна. Однако до поздней осени 2012 года никто из них не сказал ему – во всяком случае, как считал он сам, – что более года они работают над превращением CRISPR в инструмент для редактирования генома человека.
Лишь в ноябре, когда Черч приехал в Институт Брода, чтобы выступить там с лекцией, он узнал, что Чжан отправил в Science статью о применении системы CRISPR-Cas9 в клетках человека. Черч был потрясен, ведь он и сам только что отправил в тот же журнал статью на ту же тему. Он рассердился и почувствовал, что его предали. В прошлом он публиковал статьи о редактировании генома вместе с Чжаном и не понимал, что бывший студент теперь считает его конкурентом, а не соратником. “Думаю, Фэн не проникся в полной мере культурой моей лаборатории, – отмечает Черч. – А может, он просто решил, что ставки слишком высоки, и потому ни о чем мне не сказал”. Хотя Лэ Цун перешел в Институт Брода, чтобы работать с Чжаном, он по-прежнему учился в Гарварде, где Черч оставался его научным руководителем. “Я расстроился, и мне показалось, что нарушены правила, ведь мой собственный студент занимался тем, что интересовало и меня, о чем он прекрасно знал, но все же решил мне об этом не сообщать”, – говорит Черч.
Когда Черч сообщил об этом руководителю магистерской программы Гарвардской медицинской школы, тот согласился, что протокол нарушен. Затем Эрик Лэндер обвинил Черча в запугивании Лэ Цуна. “Я не хотел раздувать это дело, – утверждает Черч. – Мне казалось, что я его не запугиваю, но Эрик считал иначе. Поэтому я пошел на попятный”[193].
Чтобы разобраться в ситуации, я беседовал попеременно с разными заинтересованными лицами и снова и снова убеждался, что память часто бывает ненадежным проводником по истории. Чжан настаивает, что вообще-то сообщил Черчу о своей работе над CRISPR в августе 2012 года, когда они вместе ехали в аэропорт Сан-Франциско с передовой конференции Science Foo Camp, которая проходила в кампусе Google в часе езды оттуда. Черч страдает от нарколепсии и признает, что вполне мог заснуть, пока Чжан говорил. Но даже если все было именно так, это, по мнению Черча, не оправдывает Чжана, поскольку тот все-таки не сумел поделиться с ним своими планами, ведь Чжан не мог не заметить, что Черч не отвечает на его слова.
Однажды за ужином я попросил Лэндера изложить свою точку зрения на спор. Он утверждает, что нарколепсия Черча – “нонсенс”, и обвиняет Черча в том, что тот приступил к работе над CRISPR только после того, как Чжан сообщил ему о своих исследованиях. Когда я спросил об этом Черча, мне показалось, что черты его бесстрастного лица под густой бородой несколько напряглись. “Это абсурд, – ответил он. – Если бы мои студенты сказали, что хотят сделать себе имя на этом, я бы отошел в сторону. Мне и без того было чем заняться”.
Столкновение так огорчило кроткого и вежливого Лэ Цуна, что впоследствии он отказался от работы с тем, что связано с CRISPR. Когда я нашел его в Медицинской школе Стэнфордского университета, где он занимается исследованиями в области иммунологии и нейробиологии, он только что вернулся после медового месяца. Он считает, что не сделал ничего предосудительного, утаив от Черча подробности своей работы в лаборатории Чжана. “Это были две самостоятельные исследовательские лаборатории в двух инстит