К преподобному Иову начали приходить вельможи, просившие духовного окормления. Он стал пользоваться особым доверием и покровительством известного защитника Православия на Волыни князя Константина Острожского. Князь Константин обратился к игумену Угорницкого монастыря с просьбой отпустить преподобного Иова в его княжеский Дубенский Крестный монастырь. Игумен согласился, и через некоторое время преподобный Иов был поставлен во главе Дубенской братии. В сане игумена он пробыл более двадцати лет, к этому времени относятся заключение Брестской унии (1596 г.) и последовавшие притеснения православных. Князь Константин, под защитой которого находился преподобный Иов, имел огромное влияние на Волыни, пользовался уважением польского короля Сигизмунда III и папы римского Климента VIII. Поэтому униаты и иезуиты не решались препятствовать действиям преподобного. Во время пребывания в Дубне святой приступил к распространению православных книг. С этой целью он подвигнул некоторых на переводческую деятельность и переписку книг. По свидетельству жития, преподобный Иов и сам участвовал в этом труде.
По благословению святого в 1581-1582 гг. князь Константин издал в городе Остроге первопечатную славянскую Библию (Острожская Библия). Заботы и волнения, связанные с издательскими трудами, а также неприязнь латинян отвлекали святого Иова от монашеского делания. Поэтому он решил оставить Дубенский монастырь и около 1604 г. поселился в скромной обители неподалеку — на горе Почаевской.
Какой была эта обитель до прихода в нее преподобного Иова? Около 1240 года здесь поселились пустынножители монахи — выходцы из Киево-Печерского монастыря. Они покинули Киев, спасаясь от нашествия полчищ Батыя. В 1340 году в Почаеве совершилось чудесное явление Божией Матери в огненном столпе. До конца XVI века обитель была пустынной: иноки жили в отдельных пещерах и собирались для молитвы в небольшом храме в честь Успения Божией Матери. В 1597 году в обители появилась великая святыня — чудотворная икона Божией Матери, переданная помещицей Анной Гойской (икону подарил Гойской греческий митрополит Неофит, гостивший в ее доме).
Преподобный Иов искал в Почаевской обители безвестности и свободы для молитвы, но иноки, вскоре почувствовавшие в пришельце духовную силу, единодушно и со слезами просили его стать их игуменом. Святой был вынужден уступить, и вскоре его трудами монастырь Почаевский упрочил свое положение и возвысился над прочими западно-русскими обителями. Он стал пользоваться материальной поддержкой местных дворян, избежавших отпадения в унию. Так, в 1649 году на средства помещиков Феодора и Евы Тамашевских в обители был построен каменный храм во имя Пресвятой Троицы, в который был передан запечатленный в камне отпечаток цельбоносной стопы Божией Матери и Ее чудотворная Почаевская икона. Икона была установлена над Царскими вратами, откуда опускалась для верующих, что совершается и доныне. Это был период расцвета монастыря, число иноков в нем сильно возросло. Но вскоре последовали бедствия. В 1607 году на обитель напали татары и, ограбив, убили одного из иноков. В 1620 году внук скончавшейся Гойской, протестант Фирлей, задумал прогнать иноков с Почаевской горы, для чего отобрал у них земельные угодья и, ворвавшись со слугами в монастырь, унес чудотворную икону. После этого дом Фирлея постигли бедствия и болезни, не прекращавшиеся до тех пор, пока икона не была возвращена в монастырь. Эти события побудили преподобного Иова к большим и скорбным трудам. В течение нескольких лет он был принужден сам ездить по судам и конторам, пока, наконец, тяжба с Фирлеем не решилась в пользу монастыря. В результате огромных усилий удалось вырыть на Почаевской горе колодец и тем самым дать обители воду (соседние источники были отобраны Фирлеем).
Особенно важной для укрепления Православия на Волыни была книгоиздательская литературная деятельность преподобного Иова. В начале XVII века в этом крае осталась всего одна славянская типография — Почаевская. Ее-то и использовал преподобный в целях борьбы с иноверием. Здесь печатались книги обличительного и догматического характера, православные молитвы, послания. Долгие годы (по 1932 г.) в Почаевском монастыре хранился труд самого преподобного — «Книга блаженного Иова Почаевского, властною рукою его написанная», содержащая до 80-ти бесед, поучений, проповедей, а также выписки из святоотеческих аскетических и полемических сочинений (издана в 1884 году в Киеве на русском языке под названием «Пчела Почаевская»). Главной для преподобного была борьба с католиками и протестантскими сектами, особенно социнианской, проповедующей монотеизм в иудаистской форме. Социниане ставили Моисеевы книги выше Евангелия, отрицали догматы о Святой Троице, Божестве Иисуса Христа, Приснодевстве Марии. Именно поэтому в книге преподобного Иова эти заблуждения рассмотрены особенно подробно. Преподобный присутствовал на Киевском Соборе 1628 года, состоявшемся в связи с возвращением в Православие отпавшего в унию архиепископа Мелетия Смотрицкого. Преподобный Иов писал соборное определение, свидетельствующее о верности Восточному Православию.
Вместе с этими трудами проходила и незримая молитвенная жизнь святого. В Почаевской Лавре до сих пор сохраняется пещера, где в течение нескольких суток стоял на молитве преподобный Иов. В одну из ночей во время молитвы святого свидетели видели необычайный свет, озаривший пещеру. Кроме молитвы и богомыслия преподобный занимался физическим трудом. Он работал в монастырском саду, при его участии были вырыты два пруда вблизи обители. В период военных действий Богдана Хмельницкого против Речи Посполитой преподобный Иов давал многим людям убежище в своем монастыре. Известно также, что преподобного избрали своим духовником многие влиятельные люди того времени. Вплоть до 1649 года игуменствовал преподобный Иов, он назначил себе преемника лишь в 98-летнем возрасте, но и после того участвовал в важнейших делах обители. 21 октября 1651 года святой получил откровение о своей близкой кончине. 28 октября он, совершив Божественную литургию, мирно отошел ко Господу.
Преподобный Иов был погребен близ пещеры, где подвизался. Над его могилой часто видели чудесное сияние. Через семь лет после кончины святой Иов трижды явился во сне митрополиту Киевскому Дионисию (Балабану) и известил о том, что пришло время открыть его святые мощи.
28 августа 1659 года нетленные останки преподобного Иова были перенесены в храм Живоначальной Троицы. От них произошло много чудес, например, получил исцеление смертельно больной Досифей, описатель жития святого. В 1675 году по молитве преподобного Иова Матерь Божия спасла Почаевскую обитель от осадивших ее татар и турок. Пресвятая Богородица явилась над Почаевской горой вместе со святым Иовом; стрелы, направляемые в Нее врагами, возвращались назад и поражали тех, кто их пускал. От ужаса перед чудом мусульмане бежали.
В начале XVIII века Почаевская обитель отошла к униатам. Но чудеса исцеления от мощей преподобного Иова не прекращались. Униаты уверовали в святость преподобного, составили ему службу с акафистом и стали просить папу римского канонизировать его. Но папа отказал им по причине ревности святого о Православии.
В 1831 году Почаевская обитель вновь вернулась в ведение Русской Православной Церкви. Чудесные исцеления от мощей преподобного Иова побудили Святейший Синод вторично открыть их, что и было совершено 28 августа 1833 года. В 1858 году на месте пещерной церкви был устроен новый храм во имя преподобного Иова.
Память преподобного Иова Почаевского празднуется также 28 октября/10 ноября.
Возложь на ся иго Христово от юности, преподобне отче Иове, многолетне свято подвизался еси на поприще благочестия во обители Угорницстей и на острове Дубенстем, и, пришед к горе Почаевстей, знаменанней цельбоносною стопою Пресвятыя Богородицы, в тесней пещере каменной богомыслия ради и молитвы многократно заключался еси, и, благодатию Божиею укреплялся, мужественно потрудился еси на пользу Церкве Христовы и обители твоея, купно же и противу врагов Православия и благочестия христианскаго, и, наставив сицевому ополчению иночествующих, победити тех представил еси Владыце и Богу. Того моли спастися душам нашим.
Возсия от спуда земнаго сокровище нетленное мощей твоих, угодниче Божий, яко, благочестно пожив в вере Христа Бога нашего, достигл еси добродетелей совершенства, и, оставив сладость жития преходящаго, в пещере горы Почаевския в пощениих, молитвах и трудех свято подвизался еси, и теми тело твое увядил еси. Ныне же, прешед к Богу в безмятежный и вечный покой, молишися о всех с верою к тебе прибегающих. Радуйся, Иове, преславный угодниче Божий и обители Почаевския украшение.
О всесвятый и преславный угодниче Божий, преподобне отче наш Иове, присный о нас ко Господу молитвенниче и теплый предстателю о душах наших, к тебе всеумиленно ныне притекаем и, поминающе подвиги и чудеса твоя, яже сотворил еси и твориши на земли, просим и молим твою благостыню: якоже твердо и неизменно потрудился еси в вере Христа Бога нашего, и, сию до конца в себе и во всех присных твоих целу и невредиму сохранивый от всяких приражений вражиих и ересей тлетворных, сице и нас в Православии и единомыслии укрепи, отгоняя молитвами твоими всякую тьму неверия и неправомыслия от сердец и помышлений наших; послуживый Господу и Богу твоему делы благими и неизреченным самоотвержением в трудех, бдениих и пощениих, настави нас на путь всякия добродетели и благостыни, избавляя от искушений и грехов, удаляющих нас от Бога и повергающих в бездну зла все житие наше; явивыйся иногда с Пречистою Девою Богородицею верху горы Почаевския во спасение обители твоея от нашествия и обложения агарянскаго, и ныне ускори на помощь стране нашей противу всех врагов наших, внешних и внутренних, утверждая мир и тишину в земли нашей, да безмолвное житие поживем во всяком благочестии и чистоте; и всем к тебе притекающим и припадающим к раце честных и многоцелебных мощей твоих и твоея помощи и заступления требующим неоскудныя милости независтно подаваяй, не остави и нас, сирых и безпомощных, тебе молящихся, избавляя от всякия скорби, гнева и нужды, от глада, губительства, труса, потопа, огня, меча, нашествия иноплеменник и междоусобныя брани. Ей, угодниче Божий, призри милостивно от Престола Царя славы, Емуже ты ныне предстоиши со Архангелы и Ангелы и со всеми святыми, на обитель твою Почаевскую, еюже ты древле мудро правил еси, наздав ю всехвальным и дивным житием твоим, и сохрани ю молитвами твоими и всякий град, и страну и всех отовсюду на море и на суши, в пустынях и в заключенних многоразличных тебе призывающих, от всех зол, видимых и невидимых, да, тако твоею помощию и ходатайством спасаеми, в веце сем и по скончании живота нашего сподобимся купно с тобою славити и воспевати всечестное имя Отца, и Сына, и Святого Духа во веки веков. Аминь.