phi X 174 примерно в 5400 оснований и был удовлетворен, когда Сэнгер выяснил, что точное количество – 5386{80}.
За два года до появления статьи Сэнгера я закончил свою диссертацию в Калифорнийском университете в Сан-Диего (UCSD) и успел перейти в Университет штата Нью-Йорк в Баффало, чтобы начать собственную научную и преподавательскую карьеру. Я пропустил публикацию Сэнгера, потому что она вышла в самый разгар Бурана-77[8], к тому же спустя две недели после публикации у меня родился сын{81}. Моя лаборатория в это время работала над выделением и описанием рецепторов для нейромедиаторов – белков, обеспечивающих передачу сигналов между нервными клетками.
За десять лет, последовавших за работой над геномом phi X 174, секвенирование ДНК постепенно прогрессировало. Хотя секвенирование по Сэнгеру стало мировым стандартом, оно было медленным, очень трудоемким и требовало заметных количеств радиоактивного фосфора, у которого период полураспада – всего пара недель. Кроме того, чтение гелей с последовательностями было скорее искусством, чем наукой. В своей второй Нобелевской лекции Сэнгер описывал утомительные усилия, которых требовало раннее секвенирование ДНК, и заключал: «Судя по всему, для секвенирования генетического материала был весьма желателен новый подход»{82}.
В 1984 году я перевел свою исследовательскую команду в Национальный институт здоровья, и мы начали учиться молекулярной биологии с помощью нескольких хороших сборников рецептов по этому предмету и моих взаимодействий с Маршаллом Ниренбергом и его лабораторией, которая располагалась этажом ниже нашей в корпусе 36. За мой первый год в НИЗ мы секвенировали только один ген, адреналинового рецептора человеческого мозга{83}, используя радиоактивное секвенирование по Сэнгеру, но это заняло большую часть года. Как и Сэнгер, я был уверен, что должен быть способ получше. К счастью, это было примерно в то время, когда Лерой Худ и его команда в Калтехе опубликовали ключевую статью с описанием, как они заменили в нуклеотидах-терминаторах радиоактивный фосфат на четыре разных флюоресцентных красителя, которые, если их активировать лазерным лучом, можно было последовательно считывать прямо в компьютер{84}. Я раздобыл одну из первых автоматических ДНК-секвенирующих машин в новой компании Applied Biosystems, как раз когда начались серьезные обсуждения дикого предложения секвенировать целиком человеческий геном.
Используя новую технологию секвенирования ДНК в сочетании с компьютерным анализом, моя лаборатория быстро секвенировала тысячи человеческих генов по разработанной мною новой методике, фокусировавшейся на относительно коротких последовательностях, которые я назвал «экспрессированными метками сиквенса» (expressed sequence tags; EST){85}. Метод EST включал секвенирование экспрессированного[9] генетического материала – матричной РНК (точнее, синтезированной на ней комплементарной ДНК). Хотя с помощью методики EST мы успешно прочли несколько тысяч человеческих генов, мой подход не встретил немедленно всеобщего одобрения. Многие увидели в нем угрозу традиционному пути работы с генами: мы могли за день открыть больше генов, чем всё научное сообщество – за предыдущие десять лет. Не улучшило ситуации и то, что правительство США решило зарегистрировать патенты на все гены, идентифицированные моей командой. Наши открытия вызывали атаки и возражения, но они же приводили к некоторым заманчивым предложениям, в том числе – создать мой собственный базовый научно-исследовательский институт, каковое я и принял в 1992 году. Я назвал его Институтом геномных исследований (The Institute for Genomic Research, TIGR), и именно там, в Роквилле (штат Мэриленд), мы построили самую крупную в мире фабрику секвенирования ДНК, используя последние версии автоматических ДНК-секвенирующих машин.
Ход истории геномики изменился в 1993 году после случайной встречи на научной конференции в Бильбао, в Испании, где я обрисовал наше быстрое продвижение в открытии генов. Многие в аудитории как будто были шокированы масштабными результатами наших работ по EST и самой природой наших открытий – особенно генов, ответственных за неполипозный рак толстой кишки, открытых в сотрудничестве с Бертом Фогельштайном из Киммелевского онкологического центра Университета Джонса Хопкинса в Балтиморе. Как только рассеялась толпа, пришедшая задавать прямые вопросы, передо мной появился высокий приятного вида человек с серебристыми волосами и в очках. «Я думал, у вас есть рожки», – сказал он, намекая на демонический образ, который часто использовала пресса, изображая меня. Он представился Хэмилтоном Смитом из Университета Джонса Хопкинса. Я уже знал о Хэме по его серьезной репутации в нашей области и по Нобелевке, и мне он сразу понравился – он явно решил составить обо мне и моей науке собственное впечатление и не давать окружающим влиять на его мнение{86}.
Хэм к тому времени сделал долгую и плодотворную карьеру и теперь, в 62 года, подумывал об отставке. Когда мы разговаривали в баре, а потом на обеде после моей лекции, он высказал интересную идею: предложил свою любимую бактерию Haemophilus influenzae, из которой он выделил первые рестриктазы, в качестве идеального кандидата для секвенирования генома с применением моего подхода.
Наш первый совместный проект начался с медленного старта, поскольку Хэм объяснил, что есть проблемы с получением библиотек клонов, содержащих фрагменты генома H. influenzae. Только спустя годы он признался мне, что его коллеги в Университете Джонса Хопкинса были совсем не в восторге от нашего проекта, глядели на меня с подозрением из-за фурора, произведенного EST, и опасались, что сотрудничество со мной испортит ему репутацию. Хотя многие из них всю свою трудовую жизнь изучали H. influenzae, они не сразу оценили идею получения полной последовательности генома. Хэм в конце концов был вынужден действовать за спиной своей группы – как и я несколькими годами раньше при работе с EST{87}.
Хэм начал сотрудничать со мной в TIGR. Наша работа над проектом началась в 1994 году и вовлекла в себя большую часть моей научной команды. Мы действовали не так, как Сэнгер много лет назад с phi X 174, используя изолированные одиночные вырезанные фрагменты для секвенирования по одному за раз. Мы полностью положились на случайность. Мы разбили геном на фрагменты в смешанной библиотеке[10] и случайно выбрали двадцать пять тысяч фрагментов, чтобы получить прочитанные последовательности примерно по пятьсот букв каждая. Применив новый алгоритм, разработанный Грейнджером Саттоном, мы начали составлять величайшую на то время биологическую мозаику, собирая кусочки в исходный геном. В процессе мы разработали несколько новых методов для завершения сборки генома. Каждая отдельная пара оснований генома была точно секвенирована, а двадцать пять тысяч фрагментов аккуратно собраны. Результатом стало то, что 1,8 миллиона пар оснований генома были воссозданы в компьютере в правильном порядке.
Следующим шагом было интерпретировать геном и идентифицировать все составляющие его гены. Будучи первым, кто изучал набор генов живого самовоспроизводящегося организма, я хотел сделать гораздо больше, чем просто представить последовательность. Команда потратила значительное время, выясняя, что говорит набор генов о жизни организма. Что означает тот софт, который программирует структуры и функции жизни? Мы описали наши результаты в статье, которая была быстро принята к публикации в журнале Science и должна была выйти по расписанию в июне 1995 года. Слухи о нашем успехе поползли еще за несколько недель до ее выхода. В результате меня пригласили прочитать президентскую лекцию на ежегодной встрече Американского микробиологического общества, которая проходила в Вашингтоне 24 мая 1995 года, и я принял это предложение с условием, что на сцене ко мне присоединится Хэм. Ожидания стали физически давить на меня, когда президент общества Дэвид Шлезингер из Университета Вашингтона в Сент-Луисе объявил то, что он назвал «историческим событием».
При помощи Haemophilus influenzae мы перевели двойную спираль биологии в цифровой мир компьютера, но веселье только начиналось. Работая с геномом этой бактерии, чтобы исследовать ее биологию и как она вызывает менингит и другие болезни, мы одновременно для подтверждения методики секвенировали еще один геном – самый маленький из известных тогда бактериальных геномов, геном Mycoplasma genitalium. Когда я закончил речь, аудитория поднялась в едином порыве и устроила мне долгую и сердечную овацию. Я никогда раньше не видел на научной конференции{88} такой масштабной и спонтанной реакции.
Это был очень сладкий миг. Моя команда стала первой, когда-либо секвенировавшей геном живого организма, и не менее важным было то, что мы это сделали, разработав новый метод, который назвали «полногеномное секвенирование методом дробления[11]». Это свершение отметило начало новой эры, когда чтение ДНК живых существ стало настолько рутинным делом, что позволяло анализировать их, сравнивать и понимать.
После завершения чтения генома Haemophilus influen-zae я хотел секвенировать второй геном, чтобы мы могли сравнивать два генома, что помогло бы понять базовый набор генов, потребных для жизни. В это время Клайд Хатчинсон в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилле предложил перспективного кандидата с самым наименьшим известным геномом: вид